Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaMultipleks MILLIPLEX® do testów immunologicznych Luminex®Wskazówki dotyczące obsługi próbek | Testy MILLIPLEX®

Wskazówki dotyczące obsługi próbek | Testy MILLIPLEX®

Właściwa obsługa i przygotowanie próbek są niezbędne do przeprowadzania testów immunologicznych. Od pobierania i przechowywania próbek, po wymagania dotyczące ich rozcieńczania, każdy krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania najlepszych wyników badań. Większość zestawów MILLIPLEX® została przetestowana pod kątem surowicy, osocza i supernatantu hodowli komórkowej, a niniejszy krótki przewodnik przedstawia najlepsze praktyki w zakresie przygotowywania tych typów próbek do użycia w testach multipleksowych MILLIPLEX®.

Czytaj więcej

Obejrzyj ten film z udziałem jednego z naszych ekspertów ds. wsparcia technicznego, aby uzyskać porady dotyczące przygotowywania i obsługi próbek do użytku w testach multipleksowych MILLIPLEX®.

Ogólne wskazówki dotyczące przygotowania próbek i obchodzenia się z nimi

  • Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania próbek.
  • Stężenia analitów mogą różnić się między surowicą a osoczem. Jeśli masz możliwość użycia surowicy lub osocza, zalecamy wybranie surowicy, ponieważ jest ona czystsza.
  • Wszystkie próbki muszą być przechowywane w probówkach polipropylenowych. Nie należy przechowywać próbek w szkle.
  • Worteksowanie jest zalecane do jednorodnego przygotowania próbek.
  • Prawidłowa i spójna technika pipetowania jest kluczem do uzyskania dokładnych danych, zwłaszcza jeśli wielu użytkowników będzie generować dane we współpracy.
    • Utrzymywanie prawidłowo skalibrowanych pipet jest ważne, a szkolenie w zakresie najlepszych praktyk pipetowania może znacznie zwiększyć precyzję pipetowania.
    • Używaj pipetowania odwrotnego w celu dokładniejszego dozowania.  Zapoznaj się z filmem na górze strony, aby nauczyć się tej techniki.
  • Postępuj zgodnie z instrukcjami protokołu MILLIPLEX® dotyczącymi obsługi próbek i rozcieńczeń.
    • Zawsze czytaj cały protokół przed kontynuowaniem. Procedury są zoptymalizowane pod kątem uzyskania najlepszych wyników i mogą się różnić w zależności od zestawu.
    • Niektóre zestawy MILLIPLEX® do oznaczania biomarkerów metabolicznych wymagają dodania do próbek inhibitorów proteazy i/lub fosfatazy.
    • Inne zestawy MILLIPLEX® mogą wymagać ekstrakcji lub zakwaszenia próbki.

Przygotowanie surowicy

  • Rurki do separacji surowicy (SST) są zalecane w celu uzyskania wyższej jakości separacji.
  • Pozwolić krwi krzepnąć przez co najmniej 30 minut przed wirowaniem przez 10 minut z prędkością 1000 x g w celu oddzielenia komórek.
  • Usuń surowicę i natychmiast przeprowadź test lub podziel próbki i przechowuj je w temperaturze od -20° do -80°C.
  • Hemoliza może skutkować zwiększoną aktywnością proteolityczną i degradacją analitu, głównie z powodu enzymów uwalnianych z lizowanych komórek.
    • Śladowa hemoliza w próbkach pobranych z inhibitorami proteazy może być akceptowalna, ale hemoliza brutto prawdopodobnie zakłóci wydajność testu.
    • Jeśli musisz użyć surowicy z hemolizą lub lipemią, unikaj zanieczyszczeń, lipidów i komórek.
  • Hemoglobina (w stężeniu 10 mg/ml) jest znana z tego, że zakłóca interakcje antygen/przeciwciało.
  • Próbki należy rozcieńczyć zgodnie z określonym protokołem zestawu MILLIPLEX®.

Przygotowanie osocza

  • Zaleca się pobieranie osocza przy użyciu EDTA jako antykoagulantu.
  • Należy zachować ostrożność podczas stosowania heparyny jako antykoagulantu, ponieważ nadmiar heparyny zapewni fałszywie wysokie wartości.
    • Używaj nie więcej niż 10 IU heparyny na ml pobranej krwi.
  • Inne antykoagulanty nie zostały dokładnie przetestowane i nie są zalecane.
  • Wirować przez 10 minut z prędkością 1000 x g w ciągu 30 minut od pobrania krwi.
  • Natychmiast pobrać osocze i przeprowadzić analizę lub podzielić próbki i przechowywać je w temperaturze od -20° do -80°C.
  • Rozcieńczyć próbki zgodnie z określonym protokołem zestawu MILLIPLEX®.

Przygotowanie supernatantu z hodowli komórkowej

  • Wiruj próbki w celu usunięcia zanieczyszczeń i natychmiast przeprowadź analizę lub podziel próbki i przechowuj je w temperaturze od -20°C do -80°C.
  • W przypadku supernatantów z hodowli komórkowych należy użyć świeżej pożywki hodowlanej jako roztworu matrycy w ślepej próbie, krzywych standardowych i kontrolach.
  • Jeśli pożywka z hodowli komórkowej jest używana jako roztwór matrycy, należy upewnić się, że nie ma w niej aktywnych proteaz, fosfataz lub suplementów, które mogą zakłócać test lub generować niedokładne wyniki (np, cytokiny, ludzka surowica itp.).
  • Jeśli próbki są rozcieńczane w buforze testowym, użyj buforu testowego jako matrycy.
  • Niektóre zestawy mogą mieć określone wymagania, zawsze należy zapoznać się z protokołem zestawu przed zaplanowaniem eksperymentu.

Przygotowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

Uwaga: Przygotowanie próbki PBMC jest najważniejszym krokiem do uzyskania powtarzalnych wyników.

  • Silne detergenty są używane w buforze lizującym. Wystarczająca ilość detergentu w buforze do lizy jest wymagana do solubilizacji białek. Nie należy przekraczać całkowitego stężenia białka 5-6 mg/ml.
    • Zaobserwowano spadek sygnału dla kilku analitów przy użyciu próbek PBMC przy całkowitym stężeniu białka 6 mg/ml (nie dodano wystarczającej ilości buforu lizującego do solubilizacji białek).
  • Ponieważ w buforze lizującym stosowane są silne detergenty, próbki lizatu wymagają wystarczającego rozcieńczenia w buforze testowym w celu rozcieńczenia silnych detergentów. Należy unikać stężenia białka całkowitego w lizacie poniżej 2 mg/ml.
    • Jeśli stężenie białka w lizacie jest niższe niż 2 mg/ml, wówczas zbyt duża ilość buforu lizującego z silnymi detergentami będzie obecna w teście i spowoduje zmniejszenie sygnału.
    • Jeśli stężenie białka poniżej 2 mg/ml jest nieuniknione, zalecamy użycie mniejszej ilości próbki, minimalizując w ten sposób objętość buforu lizującego obecnego w teście.
  • Optymalne całkowite stężenie białka wynosi 2-6 mg/ml. Używając PBMC ustaliliśmy, że 10 μL buforu lizującego na 1 milion komórek PBMC daje około 2 mg/mL. Dodanie 10 μL próbki o stężeniu 2 mg/mL i 15 μL buforu testowego dało dobre wyniki. Jako punkt wyjścia zaleca się dodanie 10 μL buforu lizującego na 2 miliony komórek PBMC.
    • Nigdy nie rozcieńczaj próbek w buforze lizującym, raczej rozcieńczaj w buforze testowym, który nie zawiera silnych detergentów.

Krótki protokół dla PBMC

  1. Jeśli PBMC pochodzą z zamrożonego materiału, zaleca się pozostawienie komórek na 24 godziny w pełnej pożywce. (Odzyskiwanie trwające krócej niż 24 godziny prowadzi do spadku sygnału). Po 24 godzinach odzyskiwania należy policzyć komórki przy użyciu odpowiedniego licznika komórek.
  2. Wiruj PBMC z prędkością 1000 x g przy użyciu wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń supernatant i przemyj komórki za pomocą PBS.
  4. Wiruj PBMC z prędkością 1000 x g za pomocą wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usuń bufor płuczący i dodaj 10 μL buforu lizującego (z 2x stężonymi inhibitorami proteazy dodanymi tuż przed użyciem) na 2 miliony komórek.
  6. Delikatnie worteksuj przez 30 sekund przed przeniesieniem lizatu komórek do probówki wirówkowej.
  7. Delikatnie kołysz lizat komórek przez 10 minut w temperaturze 4°C. Peelingować nieuszkodzone komórki i organelle z prędkością 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
  8. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki wirówkowej.
  9. Zaleca się, przynajmniej po raz pierwszy, określenie całkowitego stężenia białka. Jeśli nie, zaleca się przeprowadzenie miareczkowania lizatu, zaczynając od 10 μL próbki + 15 μL buforu testowego 1 i wykonując seryjne rozcieńczenie 1:1 w buforze testowym 1. Dodaj inhibitory proteazy (takie jak Protease Inhibitor Cocktail I lub AEBSF) i/lub inhibitory fosfatazy do buforów lizujących "domowej roboty".

Aby uzyskać więcej informacji na temat całkowitego stężenia białka i buforów do lizy MILLIPLEX®, pobierz naszą Tips & Tricks brochure.

Urine Preparation

Typowo, pomiar analitów w moczu wymaga 24-godzinnej zbiórki moczu lub drugiej porannej zbiórki moczu. W przypadku drugiego porannego moczu wartość analitu jest normalizowana względem kreatyniny, tj, analit jest wyrażony jako jednostki/mg kreatyniny.

  • Krótko odwiruj próbki, aby usunąć zanieczyszczenia.
  • W przypadku korzystania z zamrożonych próbek zaleca się całkowite rozmrożenie próbek, dobre wymieszanie przez worteksowanie i odwirowanie przed użyciem w teście w celu usunięcia cząstek stałych.
  • Należy określić optymalny współczynnik rozcieńczenia próbek. Bufor testowy dostarczony w zestawie powinien być użyty jako rozcieńczalnik próbki.

Zestawy MILLIPLEX® wymagające specjalnego przygotowania próbki

Tabela 1 opisuje specjalne przygotowanie próbki wymagane dla niektórych zestawów multipleksowych MILLIPLEX®.

Nazwa zestawuNr produktu Typ próbki wymagający przygotowaniaObróbka próbki/inhibitoryŹródło inhibitora

Typ próbki wymagający przygotowaniaPróbka poddana obróbce/inhibitoryŹródło inhibitora<
Canine Gut Hormone PanelCGTMAG-98KSerum, osoczeDPP-IV, aprotynina, AEBSF, koktajl inhibitorów proteazyPatrz uwagi 1,2,3,4
Panel ludzkich hormonów metabolicznychHMHEMAG-34KSurowica, osoczeDPP-IV, aprotynina, AEBSF, koktajl inhibitorów proteazyPatrz uwagi 1,2,3,4,5
Panel ludzkiego hormonu metabolicznego V3HMH3-34KSurowica, osoczeDPP-IV, aprotynina, AEBSF, koktajl inhibitorów proteazyPatrz uwagi 1,2,3,4,5
Mouse Metabolic Hormone PanelMMHE-44KSurowica, osoczeDPP-IV, aprotynina, AEBSF, koktajl inhibitorów proteazyPatrz uwagi 1,2,3,4,5
Panel metaboliczny naczelnych.NHPMHMAG-45KSurowica, osoczeDPP-IV, aprotynina, AEBSF, koktajl inhibitorów proteazyPatrz uwagi 1,2,3,4
Panel hormonów metabolicznych szczuraRMHMAG-84KSurowica, osoczeDPP-IV, aprotynina, AEBSF, koktajl inhibitorów proteazyPatrz uwagi 1,2,3,4
Human IGF PanelHIGFMAG-52KSerum, osoczeEkstrakcjaBrak
Human IGF Binding Protein PanelHIGFBMAG-53KSurowica, osoczeKoktajl inhibitorów proteazyPatrz uwaga 4
Panel ludzkich neuropeptydówHNPMAG-35KSurowica, osoczeEkstrakcja acetonitrylemNone
Rat/Mouse Neuropeptide PanelRMNPMAG-83KSurowica, osoczeEkstrakcjaBrak
Multi-Species Hormone PanelMSHMAG-21KSurowica, osoczeEkstrakcja acetonitrylowaBrak
Panel ludzkiej skórySKINMAG-50KSkin LysatesCentrifuge to Remove DebrisNone
Wielogatunkowy panel TGFβ1 SingleplexTGFBMAG-64K-01.Serum, plazma, CCSKwaszenieBrak
Wielogatunkowy panel TGFβ1, 2, 3TGFBMAG-64K-03Surowica, osocze, CCSKwaszenieBrak
Panel ludzkiego stresu okołodobowegoHNCSMAG-35KSurowica, osoczeEkstrakcja acetonitrylemBrak

Uwagi

1. DPP-IV (produkt nr DPP4-010) jest stosowany w stężeniu 10 µL na ml krwi.
2. Pefabloc lub AEBSF (produkt nr 101500) jest stosowany w stężeniu 1 mg/ml krwi.
3. Koktajl inhibitora proteazy I (produkt nr 20-201).
4. Koktajl inhibitora proteazy (Produkt nr P2714).
5. Aktywne i całkowite nie mogą być używane razem w tym samym teście.

Tabela 1. Zestawy MILLIPLEX® wymagające specjalnego przygotowania próbki, w tym określonego typu próbki i obróbki/inhibitora.

Protokoły wykorzystujące inne typy próbek

Dostępne są protokoły dla typów próbek wykraczających poza te, które zostały przetestowane w zestawach MILLIPLEX®. Niektóre przykłady opisano w Tabeli 2.

Typ próbkiGatunekProtokółOdniesienie (jeśli dotyczy)
Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) Dla próbek z płukania należy użyć 50 μL próbki + 25 μL kulek w studzienkach na próbki. Skonfiguruj wzorce, używając jednego dodatkowego dolnego punktu i opuszczając punkt wzorcowy o najwyższym stężeniu. Użyj matrycy buforowej lub pożywki używanej do pobrania próbki popłuczyn jako matrycy, tj. 25 μL wzorca/kontroli/pustej próbki + 25 μL buforu testowego/pożywki + 25 μL kulek. Pierwsza inkubacja ze wzorcem/próbką powinna trwać przez noc w temperaturze 4°C. Wyniki należy podzielić przez 2. 
Próbki zakaźne Dla próbek zakaźnych: W przypadku mycia za pomocą automatycznej myjki do płytek, dodać 30% wybielacza do butelki na odpady przed myciem/aspiracją płytki. W przypadku mycia za pomocą ręcznego separatora kulek magnetycznych, dodaj 30% wybielacza do pojemnika zdolnego do wychwycenia roztworu myjącego zdekantowanego z płytki. Następnie pod koniec testu, przed uruchomieniem płytki w urządzeniu Luminex®, należy ponownie zawiesić kulki w 0,1 ml 4% formaldehydu sporządzonego w 10 mM PBS (przygotowywanego codziennie na świeżo) zamiast płynu osłonowego. Długotrwała inkubacja w tym roztworze może spowodować agregację kulek. W związku z tym, po mieszaniu płytki przez 5 minut w wytrząsarce orbitalnej, należy natychmiast odczytać płytkę. 
Próbki lipemiczne W przypadku próbek lipemicznych i osocza, krew musi być pobrana na lód, odwirowana w wirówce z chłodzeniem, podzielona na porcje i zamrożona w temperaturze -20°C na krótki okres (<2 miesiące) i -70°C na długi okres. Przed przystąpieniem do testu należy rozmrozić próbki i odwirować je z prędkością 10 000 obrotów na minutę przez 5 minut. Zbierz warstwę lipidową z powierzchni za pomocą bawełnianego wacika i użyj supernatantu poniżej warstwy lipidowej do testu. 
PluwoŚwieże, spontanicznie odkrztuszone próbki plwociny zostały zamrożone i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu ich przygotowania. Próbki były ultrawirowane przez 4 godziny przy 38 000 obrotów na minutę.Hansen CR, et al. "Inflammation in Achromobacter xylosoxidans infected cystic fibrosis patients." Journal of Cystic Fibrosis vol. 9 51-58. 2010. DOI: 10.1016/j.jcf.2009.10.005
ŚlinaLudzieDodaj koktajl inhibitora proteazy w stężeniu 1:500 do śliny. Wirować z prędkością 10 000 obrotów na minutę przez 10 minut i rozcieńczyć supernatant w stosunku 1:2 buforem testowym przed przygotowaniem testu. Metoda ta znacznie poprawia odzysk i zmniejsza agregację kulek. Przeprowadzić test z buforem testowym jako matrycą w krzywej standardowej. Użyj opcji nocnej, jeśli jest dostępna. 
Ekstrakcja komórek lub tkanek Protokół różni się w zależności od rodzaju tkanki i/lub analitów będących przedmiotem zainteresowania. Ogólnie rzecz biorąc, można stosować większość protokołów stosowanych w testach ELISA, ale oto kilka wskazówek dotyczących wyboru metody.

1) Homogenizuj komórki lub tkanki mechanicznie (np, ultradźwięki) w buforze na bazie PBS zawierającym inhibitory proteazy (takie jak aprotynina lub koktajl inhibitorów) i niskie (0,2%) stężenie niejonowego detergentu.

2) Medium ekstrakcyjne nie powinno zawierać żadnych rozpuszczalników organicznych, takich jak DMSO itp.

3) Odwiruj ekstrakt i zamroź supernatant w temperaturze -20°C.

4) Użyj pożywki ekstrakcyjnej jako matrycy w ślepej próbie, krzywej standardowej i kontroli jakości.		 
ŁzyLudzieNiestymulowane próbki łez pobierano nietraumatycznie z zewnętrznego kantu otwartych oczu, unikając w miarę możliwości dodatkowego odruchu łzowego. Do pobrania 1 μL łez użyto szklanych mikropipet kapilarnych (Drummond, Broomall, PA). Każda próbka została następnie rozcieńczona w stosunku 1:10 w sterylnej probówce zawierającej lodowato zimny bufor testowy. Probówki z próbkami łez były utrzymywane w niskiej temperaturze (4°C) podczas pobierania i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia testu. Próbki uzyskano z prawego oka (OD) i lewego oka (OS) każdej osoby i nie były one łączone.Enríquez-de-Salamanca, Amalia et al. "Tear cytokine and chemokine analysis and clinical correlations in evaporative-type dry eye disease." Molecular vision vol. 16 862-73. 19 May. 2010
Gingival Crevicular Fluid (GCF)HumanPróbki GCF zostały pobrane z każdego miejsca za pomocą papierowych pasków filtrujących (PerioPaper) delikatnie włożonych w miejsca od 1 do 2 mm na ~ 10 sekund. Objętość GCF obliczono za pomocą mikrowilgotnościomierza (Periotron 8000) i krzywych kalibracyjnych. Próbki zamrożono w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analiz rozpuszczalnych biomarkerów.Branco-de-Almeida LS, et al. "Local and Plasma Biomarker Profiles in Localized Aggressive Periodontitis." JDR Clin Trans Res. Jul;2(3):258-268. 2017. DOI: 10.1177/2380084417701898
Płyn surowiczy (SF)LudzkiDodaj dodatkowy punkt standardowy w porównaniu do standardowego protokołu w matrycy buforowej. Użyj 100 μL buforu + 25 μL std/próbkę. Mieszać przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 25 μL kulek i inkubować z mieszaniem przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia, przed odczytem, ponownie zawiesić kulki w 200 μL 1-krotnego buforu płuczącego przed załadowaniem do urządzenia. Odczytana objętość wynosi 100 μL na urządzeniu. 
Płyn surowiczy (SF)EquinePłyn maziowy (2 ml) pobrano aseptycznie i podzielono (probówki EDTA i Protein LoBind, Eppendorf® Labware, Westbury, CT). Wolny od antykoagulantów płyn maziowy natychmiast odwirowano przy 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a supernatant przechowywano w temperaturze -20°C. Rozmrożone próbki (200 μL) trawiono hialuronidazą (10 μL 100 IU hialuronidazy/mL buforu octanowego; Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) przez 30 minut w temperaturze 37°C, odwirowywano przy 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C i odzyskiwano supernatant.Front. Vet. Sci., 7:568756. 26 listopada 2020 r. DOI: 10.3389/fvets.2020.568756
Próbki kałuMyszZawartość kału z jelita cienkiego i grubego zebrano podczas eutanazji myszy i zamrożono w temperaturze -80°C. Próbki rozmrożono, zważono i ponownie zawieszono w PBS 5% żelatyny uzupełnionej kompletnym koktajlem inhibitorów proteazy (Roche), przy pomocy energicznego worteksowania. Próbki przygotowano w możliwie największym stężeniu, aby ułatwić wykrywanie cytokin o niskim stężeniu. Nierozpuszczalną frakcję oddzielano przez wirowanie z prędkością 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C w wirówce Eppendorf® 5417R. Supernatanty badano natychmiast lub zamrażano w temperaturze -80°C.Toxicology and Applied Pharmacology, Volume 333, 2017, Pages 84-91, ISSN 0041-008X, DOI: 10.1016/j.taap.2017.08.013
Płyn otrzewnowyMyszPo eutanazji zwierząt, 1 ml sterylnego PBS wstrzyknięto do jamy otrzewnej, delikatnie masowano obszar brzucha i zebrano płyn. Zebrany płyn odwirowano przy 1390 obrotach na minutę przez 5 minut w temperaturze 4°C, a uzyskany supernatant przechowywano następnie w temperaturze -80°C.Ruiz A, et al. Effect of hydroxychloroquine and characterization of autophagy in a mouse model of endometriosis. Cell Death Dis. 2016 Jan 14;7(1):e2059. DOI: 10.1038/cddis.2015.361.
Zaschnięte plamki krwiCzłowiekPróbki krwi włośniczkowej pobrano na kartę Whatman 903 Protein Saver Card (Maidstone, U.K.) i zamrożono za pomocą środka osuszającego w szczelnie zamkniętych torebkach przed elucją. Próbki DBS (nakłucia 2, 6 mm) eluowano i przenoszono przez 96-dołkowe Płytki Multiscreen® i Ultracel® przy użyciu buforu elucyjnego (PBS z 0,5 M NaCl i 0,1% Tween-20) przez 16-18 godzin w lodówce. Powstały eluent DBS został ponownie zawieszony w 90 ml wody wolnej od nukleaz.Prado, EA, et al. "Using Dry Blood Spots to Evaluate Serum Cytokines and Chemokines in Humans via Multiplex Technology," International Journal of Exercise Science: Conference Proceedings: Vol. 2: Iss. 6, Article 12. 2014
Tabela 2.Przykłady protokołów dla innych typów próbek niż wymienione w protokołach zestawów multipleksowych MILLIPLEX®.

Pełna lista informacji o typach próbek paneli MILLIPLEX® znajduje się w Załączniku 3 w naszej Broszura Tips & Tricks.

Request Information

Chcesz dowiedzieć się więcej o testach multipleksowych MILLIPLEX®? Sprawdź nasze FAQs lub wypełnij poniższy formularz.

Poproś o informacje na temat testów MILLIPLEX®

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Powiązane artykuły techniczne
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?

Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.