Przygotowanie komórek do elektroporacji

Elektroporacja komórek to metoda wykorzystująca pole elektryczne do zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej, dzięki czemu DNA lub inna substancja może zostać wprowadzona do komórki.

Przygotowanie odczynników do elektroporacji komórek

Tabela 1.Wymagane odczynniki

2× pożywka YT:	Rozpuścić 16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl w 900 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH. Dostosuj objętość do 1 l za pomocą wody destylowanej. Sterylizować w autoklawie przez 20 minut. Aby przygotować pożywkę stałą, dodaj 1,2% do 1,5% agaru.
1 mM HEPES:	0,26 g HEPES, sól sodowa. Rozpuścić w 900 ml wody destylowanej. Dostosować pH do 7,0. Dostosować objętość do 1 l za pomocą wody destylowanej. Sterylizować w autoklawie.
10% glicerol w 1 mM HEPES,  pH 7.0:	Aseptycznie dodać 10 mL sterylnego 100% glicerolu do 90 mL sterylnego 1 mM HEPES, pH 7.0.
10% glicerol w wodzie destylowanej:	Dodaj 10 mL 100% glicerolu do 90 mL wody destylowanej.Sterylizować w autoklawie.
Bufor izopropanolowy TE:	10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA
Fenol:	Redestylowany fenol nasycony buforem TE zawierającym 8-hydroksychinolinę
Chloroform/alkohol izoamylowy:	Reagent-grade chloroform i alkohol izoamylowy, zmieszane 24:1
Fenol/chloroform:	Równe części redestylowanego fenolu i chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1), każdy przygotowany jak opisano powyżej
3 M octan sodu, pH 5.4, roztwór wodny Etanol, 70%, 95%

Procedura

1. Zaszczepić 10 ml podłoża 2×YT szczepem gospodarza E. coli z płytki z podłożem LB lub 2×YT. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc z wytrząsaniem.
   
   
2. Zaszczepić 1 l podłoża 2× YT 10 ml całonocnej hodowli komórek gospodarza. Inkubować przez 2 do 2,5 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 rpm, aż do osiągnięcia A₆₀₀ od 0,5 do 0,7.
   
   
3. Umieścić kolbę na lodzie na 15 do 30 minut.
   
   
4. Wirować przy 4000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
   
   
5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 l lodowato zimnego sterylnego 1 mM HEPES, pH 7,0.
   
   
6. Wirować jak opisano powyżej. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 ml lodowatego sterylnego 1 mM HEPES o pH 7.0.
   
7. Wirować jak opisano powyżej. Zdekantować supernatant. Przepłukać komórki w 20 ml sterylnego 1 mM HEPES, pH 7,0, zawierającego 10% glicerolu.
   
   
8. Wirować jak opisano powyżej. Zdekantować supernatant. Zawiesić komórki w całkowitej objętości od 2 do 3 ml sterylnego 10% glicerolu w wodzie destylowanej.
   
   
9. Dozować w porcjach od 50 do 100 µL i przejść do protokołu elektroporacji lub zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -70 °C.
   
   
10. Wyekstrahować ligowany wektor pGEX (jak również niecięty wektor) raz równą objętością fenolu/chloroformu i raz równą objętością chloroformu/alkoholu izoamylowego.
    
    
11. Usuń fazę wodną i dodaj 1/10 objętości 3 M octanu sodu, pH 5,4 i 2,5 objętości 95% etanolu.
12. Usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml 70% etanolu. Wirować przez 5 minut, odrzucić supernatant i wysuszyć osad.
    
13. Zawiesić ponownie każdy osad DNA w 20 µl sterylnej wody destylowanej. Alternatywnie, DNA można oczyścić za pomocą żelu.

   Uwaga: DNA musi być całkowicie wolne od soli przed elektroporacją.

Wydajność elektroporacji

Zaleca się, aby jeden nanogram nieciętego (superzwiniętego) wektorowego DNA był transformowany równolegle z ligacjami insert/pGEX w celu określenia wydajności każdego preparatu komórek kompetentnych. Więcej informacji na temat protokołów elektroporacji można znaleźć w instrukcji wybranego systemu elektroporacji.

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500