Protokół optymalizacji stężenia primerów

Optymalizacja warunków qPCR

Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatur wyżarzania.

Jednym z podejść do optymalizacji stężeń starterów jest stworzenie matrycy reakcji. Służy ona do testowania zakresu stężeń dla każdego startera względem różnych stężeń startera partnerskiego. W przykładzie przedstawionym w tym protokole zademonstrowano macierz 6×6 testującą sześć stężeń (np. od 50 nM do 800 nM). Ilości podane w tym protokole pozwolą na wykonanie każdego warunku w dwóch egzemplarzach.

Sprzęt używany w protokole optymalizacji stężenia starterów

• Urządzenie do ilościowej reakcji PCR
• Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie)

Odczynniki

• Odpowiedni szablon testu, np.g., cDNA rozcieńczony 1:10, gDNA lub syntetyczna matryca oligo.
• KiCqStart^® SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - w zależności od urządzenia, patrz Tabela P4-6 kompatybilność urządzeń).
• Woda klasy PCR: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) w podwielokrotnościach 20 ml; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności do każdej reakcji.
• Zapasy stężenia starterów do przodu i do tyłu (zapasy robocze 10 μM).
  -   Niestandardowe oligo można zamówić na sigmaaldrich.com/oligos. 

Tabela P13-31.Przewodnik doboru mieszaniny SYBR Green PCR Mix.

Hot Start ReadyMixes (Taq, bufor, dNTPs, barwnik referencyjny, MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (Nr kat. Nr kat. KCQS00)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (Nr kat. KCQS01)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ with ROX (Nr kat. KCQS02). KCQS02)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ (Nr kat. KCQS03)
Kompatybilne urządzenia:	Kompatybilne urządzenia:	Kompatybilne instrumenty:	Kompatybilne instrumenty:
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000	Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™	Fast Applied Biosystems ViiA 7	Applied Biosystems 7300	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™	Stratagene Mx3000P®	Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™	Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler®		Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480

Dostawy

• Filtr sterylny końcówki do pipet
• Sterylne 1.5 mL zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909)
• Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z nich, aby dopasować go do żądanego formatu:
  - Pojedyncze cienkościenne probówki do PCR o pojemności 200 μL (Z374873 lub P3114)
  - Płytki
    - Płytki 96-dołkowe.płytki 96-dołkowe (Z374903)
    - płytki 384-dołkowe (Z374911)
  - uszczelki do płytek
    -&Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)
    - Folia ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)

Uwagi dotyczące tego protokołu

• cDNA jest generowane przy użyciu startera losowego lub metody primingu oligo-dT i rozcieńczane 1:10, ale można użyć dowolnej odpowiedniej, alternatywnej matrycy.
• Wszystkie próbki są wykonywane w duplikatach zgodnie z układem płytki (Rysunek P13-18).

Rysunek P13-18. Schematyczna reprezentacja układu płytki optymalizacji podkładu.

Metoda

Uwaga: 2,0 μL każdego startera zostanie dodane do reakcji o całkowitej objętości 20 μL. Z tego powodu zapasy starterów są 10 razy większe od wymaganego stężenia, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe.

1.    Używając zapasu starterów 10 μM, wykonaj rozcieńczenie obu zapasów starterów do 0.5, 1, 2, 4, 6 i 8 μM, jak pokazano w
      Tabela P13-32.

.

Tabela P13-32.Schemat rozcieńczania starterów dla optymalizacji stężenia starterów.

Stężenie końcowe (μM)	Objętość (μL) H2O	Objętość (μL) 10 μM Stock	Całkowita Objętość (μL)
0.5	47.5	2.5	50
1	45	5	50
2	40	10	50
4	30	20	50
6	20	30	50<
8	20	80	100

2.    Przygotować mieszaninę wzorcową qPCR zgodnie z Tabelą P13-33   
      (Uwaga: Szablon i cDNA są dodawane oddzielnie w kroku 5). Dobrze wymieszać.

Tabela P13-33.Mieszanina wzorcowa reakcji do optymalizacji stężenia starterów.

Odczynniki	Objętość (μL) na pojedynczą reakcję 20 μL	Objętość (μL) na całą płytkę Pojedyncza reakcja 20 μL	Objętość (μL) dla całej płytki
(84+10% błąd pipetowania)
2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	10	924
PCR grade water	3	277.2
Barwnik referencyjny (opcjonalnie)	1	92.4
Przykład, np, cDNA (rozcieńczony 1:5 do 1:10 stocka)	2	*
Forward primer	2	*
Podkład odwrotny	2	*

*Uwaga: Do nie dodawania cDNA i starterów aż do kroku 5.

3.    Usuń 184.8 μL (dla 12× NTC) mieszaniny wzorcowej z kroku 2 do oddzielnej probówki, aby użyć jej do ustawienia
       No Template Control (NTC).

4.    Dodaj 26,4 μL dH2O do mieszaniny NTC w kroku 3 (aby zastąpić matrycę).
      Uwaga:  Umieść mieszaninę NTC na lodzie do późniejszego użycia.

5.    Dodaj 158,4 μL matrycy cDNA do pozostałej mieszaniny wzorcowej z kroku 2. Umieścić mieszaninę wzorcową na lodzie.

6.    Dodać 2.0 μL odpowiednich rozcieńczeń starterów odwrotnych do płytki PCR zgodnie z Rysunkiem P13-18; dodając również
      stężenie 800 nM do rzędu NTC.

7.    Dodaj 2.0 μL odpowiednich rozcieńczeń starterów do przodu do płytki PCR zgodnie z Rysunkiem P13-18.

8.    Pobrać 16 μL mieszaniny wzorcowej z kroku 5 do płytki PCR w dołkach odpowiadających pozycjom testowym.

9.    Odmierzyć 16 μL mieszaniny wzorcowej z kroku 4 na płytkę PCR dla reakcji NTC.

10.  Zamknąć płytki i oznaczyć etykietą. (Upewnij się, że etykiety nie zasłaniają ścieżki światła wzbudzenia/detekcji urządzenia).

11.  Przeprowadź próbki zgodnie z dwuetapowym protokołem w Tabeli P13-34. Kroki 1 i 2 są powtarzane przez 40 cykli, po których następuje analiza krzywej dysocjacji.

Tabela P13-34.Warunki cyklu PCR dla optymalizacji stężenia starterów.

Warunki cyklu	Temp (°C)	Czas (sek)
Inicjał denaturacji/Hot Start	95	30
Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli
Krok 1	95	5
Krok 2	60	30

Uwaga: Użyj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych).

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500