[Przejdź do zawartości](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl) Produkty Koszyk0 PLPL Produkty [Zaloguj się / Zarejestruj się](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Wyszukiwanie zamówienia](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/order-lookup) [Szybkie zamówienie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/quick-order) Koszyk0 [Strona główna](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/applications/genomics/qpcr)Protokół optymalizacji stężenia primerów # Protokół optymalizacji stężenia primerów ## Optymalizacja warunków qPCR Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatur wyżarzania. Jednym z podejść do optymalizacji stężeń starterów jest stworzenie matrycy reakcji. Służy ona do testowania zakresu stężeń dla każdego startera względem różnych stężeń startera partnerskiego. W przykładzie przedstawionym w tym protokole zademonstrowano macierz 6×6 testującą sześć stężeń (np. od 50 nM do 800 nM). Ilości podane w tym protokole pozwolą na wykonanie każdego warunku w dwóch egzemplarzach. ## Sprzęt używany w protokole optymalizacji stężenia starterów - Urządzenie do ilościowej reakcji PCR - Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie) ## Odczynniki - Odpowiedni szablon testu, np.g., cDNA rozcieńczony 1:10, gDNA lub syntetyczna matryca oligo. - KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - w zależności od urządzenia, patrz __Tabela P4-6__ kompatybilność urządzeń). - Woda klasy PCR: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) w podwielokrotnościach 20 ml; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności do każdej reakcji. - Zapasy stężenia starterów do przodu i do tyłu (zapasy robocze 10 μM). \-   Niestandardowe oligo można zamówić na sigmaaldrich.com/oligos. Hot Start ReadyMixes (Taq, bufor, dNTPs, barwnik referencyjny, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (Nr kat. Nr kat. KCQS00)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (Nr kat. KCQS01)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ with ROX (Nr kat. KCQS02). KCQS02)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ (Nr kat. KCQS03) __Kompatybilne urządzenia:____Kompatybilne urządzenia:____Kompatybilne instrumenty:____Kompatybilne instrumenty:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700  Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900  Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast  Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT  Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s    Illumina Eco qPCR    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q    Roche LightCycler® 480    Tabela P13-31.Przewodnik doboru mieszaniny SYBR Green PCR Mix. ## Dostawy - Filtr sterylny [końcówki do pipet](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - Sterylne 1.5 mL zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909) - Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z nich, aby dopasować go do żądanego formatu: \- Pojedyncze cienkościenne probówki do PCR o pojemności 200 μL (Z374873 lub P3114) \- Płytki   - Płytki 96-dołkowe.płytki 96-dołkowe (Z374903)   - płytki 384-dołkowe (Z374911) \- uszczelki do płytek   -&Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)   - Folia ThermalSeal RT2RR™ (Z722553) ### Uwagi dotyczące tego protokołu - cDNA jest generowane przy użyciu startera losowego lub metody primingu oligo-dT i rozcieńczane 1:10, ale można użyć dowolnej odpowiedniej, alternatywnej matrycy. - Wszystkie próbki są wykonywane w duplikatach zgodnie z układem płytki (__Rysunek P13-18__). ![Schematyczna reprezentacja układu płytki optymalizacji podkładu.](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/qpcr/representation-of-the-primer-optimization.jpg "Schematyczna reprezentacja układu płytki optymalizacji podkładu.") __Rysunek P13-18.__Schematyczna reprezentacja układu płytki optymalizacji podkładu. ## Metoda *__Uwaga:__* 2,0 μL każdego startera zostanie dodane do reakcji o całkowitej objętości 20 μL. Z tego powodu zapasy starterów są 10 razy większe od wymaganego stężenia, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe. 1.    Używając zapasu starterów 10 μM, wykonaj rozcieńczenie obu zapasów starterów do 0.5, 1, 2, 4, 6 i 8 μM, jak pokazano w       __Tabela P13-32__. . Stężenie końcowe (μM)Objętość (μL) H2OObjętość (μL) 10 μM StockCałkowita Objętość (μL) 0.547.52.550 145550 2401050 4302050 6203050< 82080100 Tabela P13-32.Schemat rozcieńczania starterów dla optymalizacji stężenia starterów. 2.    Przygotować mieszaninę wzorcową qPCR zgodnie z __Tabelą P13-33__          (*__Uwaga:__* Szablon i cDNA są dodawane oddzielnie w kroku 5). Dobrze wymieszać. OdczynnikiObjętość (μL) na pojedynczą reakcję 20 μLObjętość (μL) na całą płytkę Pojedyncza reakcja 20 μLObjętość (μL) dla całej płytki (84+10% błąd pipetowania) 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™10924 PCR grade water3277.2 Barwnik referencyjny (opcjonalnie)192.4 Przykład, np, cDNA (rozcieńczony 1:5 do 1:10 stocka)2* Forward primer2* Podkład odwrotny2* Tabela P13-33.Mieszanina wzorcowa reakcji do optymalizacji stężenia starterów. *__\*Uwaga:__* Do __nie__ dodawania cDNA i starterów aż do kroku 5. 3.    Usuń 184.8 μL (dla 12× NTC) mieszaniny wzorcowej z kroku 2 do oddzielnej probówki, aby użyć jej do ustawienia        No Template Control (NTC). 4.    Dodaj 26,4 μL dH2O do mieszaniny NTC w kroku 3 (aby zastąpić matrycę).       *Uwaga:*  Umieść mieszaninę NTC na lodzie do późniejszego użycia. 5.    Dodaj 158,4 μL matrycy cDNA do pozostałej mieszaniny wzorcowej z kroku 2. Umieścić mieszaninę wzorcową na lodzie. 6.    Dodać 2.0 μL odpowiednich rozcieńczeń starterów odwrotnych do płytki PCR zgodnie z __Rysunkiem P13-18__; dodając również       stężenie 800 nM do rzędu NTC. 7.    Dodaj 2.0 μL odpowiednich rozcieńczeń starterów do przodu do płytki PCR zgodnie z __Rysunkiem P13-18__. 8.    Pobrać 16 μL mieszaniny wzorcowej z kroku 5 do płytki PCR w dołkach odpowiadających pozycjom testowym. 9.    Odmierzyć 16 μL mieszaniny wzorcowej z kroku 4 na płytkę PCR dla reakcji NTC. 10.  Zamknąć płytki i oznaczyć etykietą. (Upewnij się, że etykiety nie zasłaniają ścieżki światła wzbudzenia/detekcji urządzenia). 11.  Przeprowadź próbki zgodnie z dwuetapowym protokołem w __Tabeli P13-34__. Kroki 1 i 2 są powtarzane przez 40 cykli, po których następuje analiza krzywej dysocjacji. | | | | |--------------------------------------------|-----------|------------| | Warunki cyklu | Temp (°C) | Czas (sek) | | Inicjał denaturacji/Hot Start | 95 | 30 | | __Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli__ | | | | Krok 1 | 95 | 5 | | Krok 2 | 60 | 30 | Tabela P13-34.Warunki cyklu PCR dla optymalizacji stężenia starterów. *__Uwaga:__* Użyj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych). ## Materiały Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd Response not successful: Received status code 500 __Powiązane artykuły__ - [Projektowanie testów PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [Optymalizacja i walidacja testów PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [Synteza oligonukleotydów DNA](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis) - [Zablokowany kwas nukleinowy i drobne spoiwo / Eclipse Dark Quencher](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq) - [Kwantyfikacja oligonukleotydów](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/quantitation-of-oligos) - [Rozwiązywanie problemów z RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [Rozwiązywanie problemów z amplifikacją PCR i RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting-pcr-and-rt-pcr-amplification) - [Analiza macierzowa CGH trudnych próbek](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/array-cgh-analysis) - [Zobacz więcej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Powiązane kategorie produktów__ - [Folie i taśmy uszczelniające](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Końcówki do pipet](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) Góra __Zaloguj się, aby kontynuować__ Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować. Zaloguj się__Nie masz konta użytkownika?__Zarejestruj Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim. An unknown error has occured.