Wskazówki i porady HPLC: Właściwe przechowywanie kolumn HPLC/UHPLC

Dr. Egidijus Machtejevas, , Lead Expert, Chromatography Product & Portfolio Management

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 8

Koncepcja może wydawać się prosta. Po zakończeniu ostatniego chromatogramu dnia lub projektu odłączamy kolumnę i wkładamy ją do szuflady. Jednak co dokładnie należy zrobić z kolumną przed jej przechowywaniem? Czy procedura różni się w zależności od planowanego czasu przechowywania? W rzeczywistości jest ich całkiem sporo: planowany czas przechowywania, modyfikacja kolumny (faza stacjonarna), stężenie buforu, pH itp. We wszystkich scenariuszach przechowywania kolumn należy zachować szczególną ostrożność, jeśli używane są bufory, które zapewniają środowisko przyjazne dla mikroorganizmów. W takich przypadkach należy codziennie przygotowywać świeże bufory i filtrować je za pomocą filtrów membranowych 0,45 lub 0,22 μm. Również dodanie niewielkiej ilości rozpuszczalnika organicznego (~ 10%) lub dodanie azydku sodu (~ 0,05%) do rozpuszczalnika do przechowywania - jeśli bufory są używane do przechowywania, np. potrzebne do niektórych kolumn HILIC - może być wystarczające, aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów. Najłatwiejszym i najbezpieczniejszym sposobem przechowywania kolumny jest jednak użycie tego samego rozpuszczalnika, w którym została ona dostarczona.

Dotyczy to w szczególności faz stacjonarnych na bazie polimerów. W zależności od ich właściwości materiałowych, mogą one nie być kompatybilne z niektórymi rozpuszczalnikami organicznymi.

W przypadku kolumn z fazą normalną na bazie krzemionki, zazwyczaj zaleca się stosowanie heptanu lub izopropanolu. Osobiście mam również dobre doświadczenia z dioksanem, ponieważ dobrze usuwa resztki wody, ale nie można tego uogólniać. Niektóre fazy stacjonarne, takie jak modyfikowane aminopropylem lub diolem, mogą być skutecznie przechowywane w 2-propanolu, który jest w rzeczywistości kompatybilny zarówno z trybem fazy odwróconej, jak i normalnej. Kolumny wykluczające rozmiar powinny być przechowywane w rozpuszczalniku zgodnym z właściwościami pęcznienia opakowania.

Przechowywanie kolumn może być krótko-, średnio- i długoterminowe

W przypadku przechowywania krótkoterminowego, tj, przez noc, albo faza ruchoma użyta w ostatniej analizie może pozostać w kolumnie, albo możliwe jest, że faza ruchoma przepływa z bardzo niskim natężeniem przepływu (zwłaszcza jeśli stężenie buforu w fazie ruchomej jest wysokie, 50 mM). W takich przypadkach kondycjonowanie kolumny można potencjalnie pominąć przed kontynuowaniem analizy następnego dnia. Opcja ta jest szczególnie zalecana w przypadku separacji w fazie normalnej, gdzie zmiana składu fazy ruchomej może skutkować długotrwałą ponowną kalibracją. Jeśli jednak stężenie buforu w fazie ruchomej jest bardzo wysokie (0,5 M), wówczas żywotność części pompy (np. wtryskiwacza & zaworów przełączających) może zależeć od czasu ich kontaktu z buforem o wysokim stężeniu. To samo dotyczy kolumny, jeśli pH jest zbliżone do limitu kolumny (dla większości kolumn opartych na krzemionce - pH 2 do pH 7). Niektóre sole, takie jak sole chlorkowe stosowane w szczególności w chromatografii jonowej, są bardzo korozyjne dla stali nierdzewnej i mogą atakować ścianki kolumny, a także wlot i wylot fryt. W takich przypadkach kolumnę (i cały system) należy przepłukać mniej agresywną fazą ruchomą. W takim przypadku zalecałbym przepłukanie kolumny fazą ruchomą bogatą w wodę (~90%) o objętości około 10 kolumn (przybliżone objętości kolumn dla niektórych popularnych wymiarów podano w Tabeli 1).

Tabela 1.Przybliżone objętości kolumn dla niektórych popularnych wymiarów kolumn i ich wielokrotności

Długość (mm)	ID (mm)	Przybliżona objętość kolumny (mL)	10 objętości kolumn (mL)	15 objętości kolumn (mL)
250	4.6	4.15	41.5	62.3
250	2.0	0.79	7.9	11.8
150	4.6	2.49	24.9	37.4
150	2.0	0.47	4.7	7.1
100	4.6	1.66	16.6	24.9
100	2.0	0.31	3.1	4.7
50	4.6	0.83	8.3	12.5
50	2.0	0.16	1.6	2.4
25	4.6	0.42	4.2	6.2
25	2.0	0.08	0.8	1.2
Uwaga: Objętość zalecanej fazy ruchomej wskazana w tabeli musi faktycznie przejść przez kolumnę. Należy pamiętać, że w przypadku wymiany butelki z rozpuszczalnikiem i usunięcia rurki z jednego rozpuszczalnika i umieszczenia jej w innym pojemniku, należy wziąć pod uwagę objętość rurki (~ 2-3 ml), odgazowywacza (starsze odgazowywacze mogą mieć do 15 ml, nowsze ~ 4 ml), pompy (~ 1 ml) i wtryskiwacza, aż nowy rozpuszczalnik dotrze do kolumny. W zależności od szybkości przepływu, należy dodać dodatkowy czas na procedurę płukania.

W przypadku odłączenia kolumny od urządzenia, zatyczki końcowe powinny być szczelnie zamocowane, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika, w przeciwnym razie może dojść do wysuszenia fazy stacjonarnej. Najgorszym scenariuszem jest nieprawidłowo umyta kolumna używana wcześniej z wysokim stężeniem soli i pozostawiona do wyschnięcia w czasie, co powoduje tworzenie się kryształów soli. Kolumna najprawdopodobniej zostanie nieodwracalnie uszkodzona. Niektóre kolumny mogą być przechowywane w stanie suchym, inne nie. Należy sprawdzić wytyczne producenta dotyczące pielęgnacji kolumn. Standardowe kolumny HPLC powinny być przechowywane wyłącznie w temperaturze pokojowej i nigdy w zamrażarce (wyjątek stanowią kolumny powinowactwa modyfikowane białkami lub aktywne reaktory enzymatyczne). Zalecenia zawarte w tym paragrafie dotyczą również średnio- i długoterminowego przechowywania kolumn.

Przechowywanie w średnich odstępach czasu, tj. 2 dni lub przez weekend. Kolumny należy przepłukać. Intensywność lub objętość płukania zależy od stężenia buforu używanego podczas analizy. Ogólnie zaleca się, aby najpierw wypłukać środki buforujące z kolumny za pomocą około 10 objętości kolumny fazy ruchomej z 10% rozpuszczalnikiem organicznym w wodzie. W takim przypadku płukanie będzie skuteczne, a także unikniemy wytrącania się buforu i możliwych problemów z odwadnianiem kolumny. Gdy bufor zostanie wypłukany, należy pompować 100% rozpuszczalnika organicznego przez 15 objętości kolumny. Kolumnę można następnie pozostawić podłączoną do urządzenia lub odłączyć i zamknąć zatyczkami.

Przechowywanie kolumny HILIC w mieszaninie acetonitrylu i wody może wymagać długiego czasu na ponowną kalibrację, jeśli do metody analitycznej używany jest bufor o niskiej sile jonowej, taki jak 5 mM octan amonu. Dlatego w przypadku kolumn HILIC zaleca się przechowywanie ich w rozpuszczalnikach zawierających 80-90% acetonitrylu i buforach zawierających 5-10 mM octanu amonu lub mrówczanu amonu.

Fazy jonowymienne i mieszane zawierające grupy funkcyjne kwasu karboksylowego (na przykład słabe fazy kationowymienne) nie mogą być przechowywane w roztworach zawierających alkohole, ze względu na możliwą powolną estryfikację i wynikającą z tego zmianę selektywności/wydajności.

W przypadku długotrwałego przechowywania (>2-3 dni), kolumny na bazie krzemionki, po prawidłowym przemyciu co najmniej 15 objętości kolumny (Tabela 1) przy użyciu ~ 10% rozpuszczalnika organicznego w wodzie, powinny być następnie przepłukane fazą ruchomą bogatą w substancje organiczne przez co najmniej 10 objętości kolumny, a następnie powinny być przechowywane w rozpuszczalniku aprotycznym. Jeśli woda jest również obecna, nie powinna być w wyższych stężeniach (mniej niż 50%).Najlepszym rozpuszczalnikiem do przechowywania zalecanym w literaturze jest acetonitryl lub metanol (istnieją pewne wyjątki, takie jak kolumny z modyfikacją amidową, które powinny być przechowywane wyłącznie w acetonitrylu). Niektóre badania¹ wskazują również, że w warunkach RP szybkość erozji i korozji elementów HPLC ze stali nierdzewnej przy użyciu czystego acetonitrylu lub metanolu była wyższa niż w przypadku zmieszania ich z wodą. Dlatego 90% acetonitryl lub metanol są doskonałymi środkami do długoterminowego przechowywania większości kolumn z odwróconą fazą.

Jednak moim osobistym ulubionym rozwiązaniem do przechowywania jest mieszanina izopropanolu i wody (80/20), ze względu na wyższe ciśnienie pary izopropanolu i mniejsze ryzyko wyschnięcia kolumny, nawet jeśli złącza końcowe nie są całkowicie uszczelnione. Izopropanol jest również silniejszym eluentem, dlatego po przechowywaniu w izopropanolu możemy być pewni, że jeszcze więcej zanieczyszczeń zostanie usuniętych niż w przypadku gradientów acetonitrylu lub metanolu. Co nie mniej ważne, izopropanol jest również mniej toksyczny. Ważne jest również, aby pamiętać, że wszystkie fazy ruchome używane do płukania, mycia lub przechowywania kolumn muszą być tej samej jakości, co te używane do analizy. Kolumny powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej (wyjątki obejmują kolumny powinowactwa, jak wspomniano wcześniej) w oryginalnym pudełku, z kopią certyfikatu analizy (CoA) / raportu kolumny i ewentualnie z dziennikiem kolumny, aby pokazać poprzednie zastosowania i pomóc użytkownikowi ocenić kolumnę przed przyszłym użyciem.

Jak długo można przechowywać kolumny? Zależy to od wielu czynników. Niektóre kolumny nie zmieniają się nawet po 5 lub 10 latach przechowywania. Jeśli zdecydujesz się użyć kolumny po tak długim okresie czasu, załóż, że kolumna najprawdopodobniej wyschła i należy ją ponownie zwilżyć, najpierw przepłukując 100% acetonitrylem (fazy RP), a następnie wyrównać w fazie ruchomej przez około 1 godzinę przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów selektywności. Dodatkowo należy rozważyć przeprowadzenie testu kolumny i porównanie danych z CoA lub poprzednimi testami kolumny.

Prawidłowe przechowywanie kolumny jest niezbędne dla prawidłowej chromatografii i przedłużenia jej żywotności.

Aby uzyskać więcej informacji na temat opracowywania metod HPLC, pobierz A Practical Guide to HPLC - Method Development Guide lub obejrzyj nasze webinarium Opracowanie metody HPLC w 1.5 dni z wykorzystaniem koncepcji selektywności

 

Narzędzia workflow LC-MS można znaleźć pod adresem SigmaAldrich.com/lcms

Referencje

1. Mowery RA. 1985. The Corrosion of 316 Stainless Steel in Process Liquid Chromatography with Acetonitrile or Methanol Carriers. Journal of Chromatographic Science. 23(1):22-29. https://doi.org/10.1093/chromsci/23.1.22