Các giao thức biến đổi vi khuẩn

Biến đổi là một quá trình quan trọng trong nhân bản phân tử, theo đó nhiều bản sao của các phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra. Khả năng lấy vật liệu di truyền miễn phí, ngoại bào là điều kiện tiên quyết cho các tế bào có khả năng của vi khuẩn trải qua quá trình biến đổi. Mục tiêu là để có được sự sao chép trình tự quan tâm của một plasmid tái tổ hợp.

Hình 1. Biến đổi

Trước khi bắt đầu chuyển đổi:

• Prepare LB agar plates and allow to set. Nếu đang sử dụng các tấm đổ trước, đảm bảo các tấm được hâm nóng đến 37 °C.
• Tùy thuộc vào dấu hiệu kháng sinh có trong DNA plasmid, kết hợp kháng sinh thích hợp trong thạch LB.
• Nếu cần sàng lọc màu xanh dương/trắng đối với chất tái tổ hợp, kết hợp IPTG 1 mm, 300 µg/mL S-Gal hoặc 40 µg/mL X-Gal và 500 µg/mL ferric ammonium citrate trong thạch LB.
• Nếu sử dụng các tế bào điện cực, đặt buồng điện cực lên nước đá.
• Đun nóng bồn nước đến 37 °C.
• Hâm nóng môi trường SOC vô trùng đến nhiệt độ phòng (hoặc 20-25 °C trong bồn nước).

Giao thức biến đổi sử dụng các tế bào có năng lực hóa học

Materials required but not provided:

Giao thức biến đổi tiêu chuẩn

1. Chuyển số ống yêu cầu từ tủ đông -70° C sang nước đá ướt. Bao gồm một ống bổ sung để kiểm soát DNA, nếu muốn
2. Để các tế bào tan trong 5 phút. Chạm nhẹ ống nhiều lần để có hệ thống treo đồng nhất
   1. For control: Thêm 1 µL (10 ng) pUC19 kiểm soát DNA vào một ống. Trộn bằng cách chạm nhẹ nhàng và đặt trên đá
   2. Thêm 1 ng đến 50 ng DNA plasmid đã tinh chế trực tiếp vào các tế bào trong phần còn lại của ống. Trộn bằng cách chạm nhẹ nhàng và đặt trên đá
3. Ủ các tế bào trên băng trong 30 phút
4. Chuyển các tế bào đến bồn nước 37° C đến  45 giây một cách phản kháng
5. Chuyển các tế bào sang nước đá trong 2 phút
6. Thêm SOC trung bình vào từng ống. Chuyển các tế bào vào ống polypropylene vô trùng và nới lỏng nắp để tạo điều kiện cho việc sục khí nuôi cấy
7. Ấp các tế bào trên lồng ấp máy rung (225-250 rpm) ở 37° C trong 1 giờ
8. Pipette 10-100 µL của mỗi huyền phù tế bào chuyển đổi lên các đĩa thạch LB với kháng sinh chọn lọc và lây lan nó bằng cách sử dụng máy rải vô trùng
9. Ấp các tấm ở 37° C qua đêm
10. Chọn thuộc địa (thuộc địa) và văn hóa nếu cần
11. Cô lập DNA plasmid từ mỗi nuôi cấy
12. Văn hóa các bản sao ưa thích
13. Phân loại DNA plasmid bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn; tách biệt bằng điện di gel

Giao thức chuyển đổi sử dụng tế bào điện năng

Materials required but not provided:

Giao thức biến đổi tiêu chuẩn

1. Chuyển số ống yêu cầu từ tủ đông -70° C sang nước đá ướt. Bao gồm một ống bổ sung để kiểm soát DNA, nếu muốn.
2. Để các tế bào tan trong 5 phút. Chạm nhẹ ống nhiều lần để có hệ thống treo đồng nhất.
3. Chuyển môi trường SOC sang các ống nuôi cấy, một cho mỗi phản ứng biến đổi và để ở nhiệt độ phòng.
   
   (Thể tích môi trường SOC phụ thuộc vào thể tích của các tế bào sẽ được thêm vào trong bước tiếp theo. Thể tích cuối cùng với các tế bào có năng lực và môi trường SOC phải là 1000 µL)
4. Đặt cuvette tiêu chuẩn 1 mm và ống vi ly tâm vô trùng lên nước đá, mỗi cái cho mỗi phản ứng biến đổi.
5. Chuyển các tế bào có khả năng vào các ống máy ly tâm vi mô đã ướp lạnh. Sử dụng 40 µL của các tế bào từ gói 80 µL và 50 µL của các tế bào từ gói 100 µL.
   1. For control: Thêm 1 µL của 1 đến 5 DNA điều khiển pUC19 pha loãng vào một ống.
   2. Chuẩn bị pha loãng gấp 1 đến 5 lần DNA hoặc hỗn hợp phối tử trong bộ đệm TE. Add to microfuge tubes.
6. Hút hỗn hợp DNA và tế bào vào miếng cuvette 1 mm lạnh.
7. Đặt bộ điện cực ở cường độ từ 25 kV/cm trong 6 ms và xử lý các tế bào.
8. Lấy các ô ra khỏi cuvette và thêm vào các ống có chứa SOC medium.
9. Ủ các tế bào trên lồng ấp máy rung (225-250 rpm) ở 37° C trong 1 giờ
10. Pipette 10-100 µL của mỗi huyền phù tế bào chuyển đổi lên các đĩa thạch LB với kháng sinh chọn lọc và lây lan nó bằng cách sử dụng máy rải vô trùng.
11. Ấp các tấm ở 37° C qua đêm.
12. Chọn thuộc địa và văn hóa nếu cần.
13. Cô lập DNA plasmid từ mỗi nuôi cấy.
14. Phân loại DNA plasmid bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn; tách biệt bằng điện di gel.
15. Văn hóa các bản sao ưa thích.

Các mẹo quan trọng để tối ưu hóa quy trình chuyển đổi:

• Xác nhận rằng các ô vẫn còn đông lạnh và đá khô vẫn còn hiện diện khi nhận.
• Để đạt hiệu quả biến đổi tối đa, hãy sử dụng mẫu DNA chất lượng cao không chứa phenol, ethanol, protein, muối hoặc chất tẩy rửa. Khi sử dụng các tế bào có điện, hàm lượng muối cao trong DNA sẽ dẫn đến hồ quang điện ở điện áp cao có thể làm hỏng mẫu và thiết bị.
• DNA trong các phản ứng phối tử có chứa thuốc thử chất lượng cao có thể được sử dụng để biến đổi. Không cần phải bất hoạt DNA ligase.
• Luôn giữ các tế bào có năng lực trên đá; ngăn chặn sự nóng lên ngẫu nhiên của các tế bào.
• Chạm nhẹ vào các ống để có được hệ thống treo tế bào đồng nhất. Không trộn lẫn bằng cách sử dụng vortex hoặc ống hút.
• Đĩa thạch LB ấm đến 37 °C để tăng trưởng tập đoàn tối ưu.
• Cài đặt bộ điện chuyển hóa sử dụng các tế bào điện:
  • BTX Model ECM 630: Chế độ HV, 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, 1 mm cuvette
  • BioRad Gene Pulser: 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, 1 mm cuvette

Tài liệu tham khảo

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu. Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994