Restriction endonuclease - The Molecular Scissors (ấn bản 2)

Hoàn cảnh

Thuật ngữ "enzyme hạn chế" bắt nguồn từ các nghiên cứu về Enterobacteria phage λ (phage lambda) trong các phòng thí nghiệm của Werner Arber và Matthew Meselson. Khả năng của một số E col nhất định ức chế hoạt động của phage lambda bởi sự phân cắt enzyme của DNA thể thực khuẩn đã được nghiên cứu và enzyme chịu trách nhiệm cho sự hạn chế tăng trưởng này được gọi là enzyme giới hạn.^{1, 2, 3}

Werner Arber, Daniel Nathans, và Hamilton O. Smith đã được trao giải Nobel Sinh lý học và Y khoa năm 1978 vì đã khám phá và đặc tính hóa các enzyme giới hạn, dẫn đến sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp.

Giới thiệu

Các enzyme giới hạn còn được gọi là "kéo phân tử" vì chúng tách DNA tại hoặc gần các trình tự nhận dạng cụ thể được gọi là các vị trí hạn chế. Những enzyme này thực hiện một lần rạch trên mỗi chuỗi DNA và còn được gọi là endonuclease giới hạn.⁴

Virus lây nhiễm vào tế bào chủ bằng cách tiêm DNA của chúng vào tế bào. DNA virus này chiếm quyền kiểm soát bộ máy của tế bào chủ để tái tạo thế hệ con cháu của virus, dẫn đến cái chết của tế bào chủ. Để khắc phục sự nhiễm virus, nhiều vi khuẩn và vi khuẩn cổ đã tiến hóa một số cơ chế. Một cơ chế bảo vệ chính liên quan đến việc sử dụng các enzyme hạn chế để làm suy giảm DNA của virus xâm nhập bằng cách tách nó tại các vị trí hạn chế cụ thể. Đồng thời, tế bào chủ bảo vệ DNA của chính nó khỏi bị phân cắt bằng cách sử dụng các enzyme khác gọi là methylase, mà methylate adenine hoặc cytosine base trong các trình tự nhận dạng vật chủ. Đối với mỗi enzyme giới hạn, tế bào chủ tạo ra một methylase tương ứng mà methyl hóa và bảo vệ DNA vật chủ khỏi sự thoái hóa. Những enzyme này tạo nên các hệ thống hạn chế sửa đổi (R-M).

Các enzyme giới hạn xúc tác quá trình thủy phân liên kết giữa nguyên tử oxy sinh hoạt 3 và nguyên tử phốtpho trong xương sống phosphodiester của DNA. Các enzyme đòi hỏi Mg²⁺ hoặc các ion hóa trị hai khác cho hoạt động của chúng.

Danh pháp

Smith và Nathans đề xuất các hướng dẫn đặt tên cho các endonuclease hạn chế vào năm 1973. Theo những hướng dẫn này, tên của các enzyme bắt đầu bằng một từ viết tắt ba chữ cái in nghiêng. Chữ cái đầu tiên chỉ ra chữ cái đầu tiên của chi vi khuẩn mà từ đó enzyme đã được phân lập và hai chữ cái tiếp theo có nguồn gốc từ các loài vi khuẩn. Có thể tiếp theo là các chữ cái hoặc số phụ để chỉ ra kiểu huyết thanh hoặc chủng. Tiếp theo là một không gian và một chữ số La Mã để chỉ ra niên đại của việc nhận dạng. Vídụ, HInd III là enzyme thứ ba trong số bốn enzyme phân lập từ Haemophilus influenz aserotype d.⁶

Các loại enzyme hạn chế

Dựa trên thành phần, các đặc điểm của vị trí phân tách và các yêu cầu cofactor, các endonuclease giới hạn được phân loại thành bốn nhóm, Loại I, II, III và IV.

Các enzyme loại II không yêu cầu ATP cho hoạt động của chúng và chúng tách ra gần hoặc trong vị trí nhận dạng. Những enzyme này là những enzyme được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích gen và nhân bản, và được phân loại thành một số phân nhóm:⁷

Vị trí phân cắt được biểu thị bằng mũi tên màu đỏ trong bảng.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme hạn chế

Tùy thuộc vào DNA cơ chất và các điều kiện phản ứng, các enzyme giới hạn cho thấy một sự thay đổi rộng rãi của sự phân tách và hoạt động của sao có thể xảy ra. Để có được sự phân tách mong muốn, điều quan trọng là phải kiểm soát các yếu tố sau:

1. Hoạt động của sao: Trong điều kiện phản ứng tối ưu, một số enzyme giới hạn tách các chuỗi base tại các vị trí khác với trình tự nhận dạng được xác định. Nói cách khác, chúng tách ra tại các địa điểm không cụ thể. Hiện tượng này được gọi là hoạt động sao. Một số yếu tố gây ra hoạt động của sao là nồng độ muối và glycerol cao, sự hiện diện của tạp chất, enzyme quá mức so với DNA cơ chất, tăng thời gian ủ bệnh, hoặc bộ đệm và đồng yếu tố không tương thích.
2. Methyl hóa DNA: Một số phân tử DNA được methyl hóa tại vị trí nhận dạng, làm cho chúng kháng với sự phân cắt bởi một số enzyme hạn chế nhất định. Ví dụ, hầu hết  các phân đoạn E. col biểu thị Dam hoặc DCM methyltransferase mà các vị trí nhận dạng cụ thể methylate để tạo thành G6mATC và C5mCA / TGG, tương ứng. G6mATC có khả năng chống phân cắt bởi MBO I. 
3. Nhiệt độ: Hầu hết các endonuclease tiêu hóa tối ưu DNA đích ở 37 °C. Tuy nhiên, có một số ngoại lệ với nhiệt độ tối ưu thấp hơn hoặc cao hơn. Ví dụ, Taq  Ioptimally tiêu hóa ở 65 °C và Apa I (Catalog số 10899208001) tiêu hóa ở 25 °C.

Isoschizomers và Neoschizomers 6

Isoschizomer là các enzyme giới hạn với cùng trình tự nhận dạng và các vị trí phân cắt. Ví dụ: SPH I (CGTAC/G) và Bbu I (CGTAC/G)

Neoschizomer là các enzyme giới hạn với cùng một trình tự nhận dạng nhưng tách DNA tại một vị trí khác trong trình tự đó. Ví dụ: Tai I (ACGT/) và  Mae II (A/CGT)

Sản phẩm tiêu hóa hạn chế

Hạn chế tiêu hóa DNA sợi kép tạo ra hai loại đầu: Đầu dính và đầu Blunt.

Đầu cùn giúp đảm bảo an toàn cho một nhóm 5-phosphat, thúc đẩy việc phối tử. Chúng tương thích phổ biến với các DNA kết thúc cùn khác.

Kết thúc cùn được tạo bởi EcoR V

Đầu dính sare những đoạn DNA sợi đơn có khả năng tự phối hoặc phối tử với một vùng bổ sung từ một phân tử DNA khác. Các đầu dính có 3-hoặc 5-nhô ra sinh hoạt trong 1-4 nucleotide.

5 đầu gắn kết được tạo bởi bln I (Catalog số 11558170001)

3 đầu gắn kết được tạo bởi KPN I

Buffer System

Việc thu thập enzyme giới hạn của chúng tôi đã được tối ưu hóa để tiêu hóa bằng năm bộ đệm duy nhất. Khi tiêu hóa DNA bằng một enzyme duy nhất, hãy sử dụng bộ đệm được cung cấp cùng với enzyme. Để tiêu hóa kép DNA, sử dụng bộ đệm trong đó cả hai enzyme đều cho thấy hoạt động 100%. Ngoài ra, bộ đệm tối ưu có thể được xác định từ tiếng vang thứ ba của các quá trình tiêu hóa kép phổ biến. Trong một số trường hợp, tiêu hóa tuần tự được khuyến nghị do không tương thích bộ đệm (thành phần hoặc nhiệt độ). Đối với các giao thức về tiêu hóa hạn chế với một enzyme, hai enzyme giới hạn và tiêu hóa DNA tuần tự, tham khảo Restriction enzim Digest Protocol. Việc lựa chọn đúng bộ đệm là rất quan trọng để có được hoạt động cao của cả hai enzyme và để tránh hoạt động của sao. Lựa chọn năm bộ đệm cho phép người dùng chọn bộ đệm tương thích để tiêu hóa mong muốn. Hầu hết các quá trình tiêu hóa đòi hỏi 1–2 bộ đệm, trở nên hiệu quả về mặt chi phí.

Ứng dụng

Khả năng hạn chế endonuclease để tách DNA tại các vị trí nhận biết cụ thể đã cho phép sử dụng rộng rãi các enzyme này như là công cụ thiết yếu trong một số kỹ thuật sinh học phân tử. Một số ứng dụng chính được giải thích dưới đây:

1. Nhân bản phân tử: Một ứng dụng phổ biến của các enzyme giới hạn đã được tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp. Quá trình này liên quan đến việc cắt DNA của người hiến tặng (thường là một plasmid) và DNA vector (thường là một gen từ một sinh vật khác) bằng một enzyme giới hạn để tạo ra các đầu tương thích. Những mục đích này có thể là 'blunt' hoặc là 'sharny' sinh hoạt. Hai DNA được tách ra được kết hợp với nhau bằng cách sử dụng một enzyme gọi là DNA ligase để tạo ra một phân tử DNA tái tổ hợp. DNA tái tổ hợp này, sau đó, có thể được đưa vào một sinh vật chủ để sao chép. Để biết thêm chi tiết, hãy tham khảo Sổ tay hướng dẫn nhân bản enzyme hạn chế
   
2. Ánh xạ DNA, còn được gọi là ánh xạ hạn chế, liên quan đến việc sử dụng endonuclease hạn chế để thu được thông tin cấu trúc của đoạn DNA hoặc bộ gen. Ánh xạ liên quan đến việc xác định thứ tự của các vị trí enzyme giới hạn trong bộ gen. DNA quan tâm, có cấu trúc được xác định, được phân cắt bằng một loạt các endonuclease giới hạn để tạo ra các đoạn DNA khác nhau về kích thước. Những mảnh vỡ này được tách ra trên một gel agarose để xác định cấu trúc của DNA quan tâm.
   Dựa trên các vị trí enzyme giới hạn đã biết của một đoạn DNA cụ thể, các endonuclease hạn chế có thể được sử dụng để xác minh danh tính của đoạn DNA đó.
3. Hạn chế quét bộ gen mốc gis Một phương pháp phân tích bộ gen sử dụng sự kết hợp của các enzyme giới hạn để hình dung sự khác biệt về mức độ methyl hóa trên bộ gen của một sinh vật nhất định. Nó là một kỹ thuật hữu ích để xác định độ lệch so với bình thường trong bất kỳ DNA nào. Nó rất hiệu quả trong việc phát hiện hyper / hypomethylation trong các khối u, xóa hoặc khuếch đại gen, hoặc thay đổi biểu hiện gen trong suốt sự phát triển của một sinh vật.⁸
4. Gene sequencing: Một phân tử DNA lớn có thể được giải trình tự bằng cách tiêu hóa nó với các enzyme giới hạn và xử lý các mảnh kết quả thông qua một trình tự DNA.
5. Đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP) liên quan đến việc tiêu hóa một mẫu DNA bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn, tách các đoạn này dựa trên chiều dài bằng điện di gel và chuyển chúng lên màng. Những mảnh này sau đó được liên kết với một đầu dò phóng xạ hoặc huỳnh quang nhắm mục tiêu các trình tự cụ thể được phân tách bởi các vị trí enzyme giới hạn. Một RFLP xảy ra khi độ dài đoạn kết quả khác nhau giữa các cá thể. Mỗi cá nhân có một mô hình duy nhất được gọi là 'mã vạch sinh học sinh học'. Kỹ thuật này là kỹ thuật phân tích DNA đầu tiên được sử dụng trong lập bản đồ gen, địa phương hóa gen cho các rối loạn di truyền, xác định nguy cơ mắc bệnh và xét nghiệm quan hệ cha con.⁹
6. Điện di gel trường xung liên quan đến việc tách các mảnh DNA lớn, chủ yếu là các mảnh do tiêu hóa bộ gen vi khuẩn với một enzyme giới hạn cắt hiếm. Mô hình độc đáo được sản xuất được sử dụng để phân biệt các chủng vi khuẩn khác nhau. Nó có thể hữu ích để xác định một chủng đặc biệt là nguyên nhân gây ra một căn bệnh lan rộng.^{10, 11}
7. Phân tích nối tiếp biểu hiện gen (SAGE) là một kỹ thuật liên quan đến phân tích định lượng và đồng thời của một số lượng lớn các phiên mã dưới dạng các thẻ nhỏ. Enzyme giới hạn được sử dụng như một enzyme neo và một enzyme gắn thẻ trong kỹ thuật này.¹²
8. Sự tích hợp qua trung gian enzyme giới hạn (REMI) liên quan đến việc sử dụng các enzyme giới hạn để tạo ra các kết thúc gắn kết tương thích trong bộ gen để chèn một hỗn hợp DNA plasmid đã được tuyến tính hóa với một enzyme giới hạn. DNA plasmid được chuyển đổi thành tế bào chủ cùng với một enzyme giới hạn tạo điều kiện cho việc tích hợp DNA vào các vị trí hạn chế cùng gốc trong nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này rất hữu ích cho các màn hình di truyền và cho việc chèn các dấu hiệu di truyền và phân tử tại các điểm cụ thể trong bộ gen để xác định các gen thú vị dựa trên kiểu hình đột biến của chúng.¹³

Tài liệu tham khảo

1. Arber W, Linn S. 1969. DNA Modification and Restriction. Annu. Rev. Biochem.. 38(1):467-500. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.38.070169.002343

2. MESELSON M, YUAN R. 1968. DNA Restriction Enzyme from E. coli. Nature. 217(5134):1110-1114. https://doi.org/10.1038/2171110a0

3. Dussoix D, Arber W. 1962. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 5(1):37-49. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(62)80059-x

4. Roberts RJ, Murray K. 1976. Restriction Endonuclease. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 4(2):123-164. https://doi.org/10.3109/10409237609105456

5. Kessler C, Manta V. 1990. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases ? a review (edition 3). Gene. 92(1-2):1-240. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90486-b

6. Roberts RJ. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. 31(7):1805-1812. https://doi.org/10.1093/nar/gkg274

7. Pingoud A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases. 29(18):3705-3727. https://doi.org/10.1093/nar/29.18.3705

8. Costello JF, Plass C, Cavenee WK. Restriction Landmark Genome Scanning.053-070. https://doi.org/10.1385/1-59259-182-5:053

9. Bernatzky R. 1989. Restriction fragment length polymorphism.467-484. https://doi.org/10.1007/978-94-009-0951-9_24

10. Blanc DS, Struelens MJ, Deplano A, De Ryck R, Hauser PM, Petignat C, Francioli P. 2001. Epidemiological Validation of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Patterns for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 39(10):3442-3445. https://doi.org/10.1128/jcm.39.10.3442-3445.2001

11. Herschleb J, Ananiev G, Schwartz DC. 2007. Pulsed-field gel electrophoresis. Nat Protoc. 2(3):677-684. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.94

12. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995. Serial Analysis of Gene Expression. Science. 270(5235):484-487. https://doi.org/10.1126/science.270.5235.484

13. Kuspa A. Restriction Enzyme-Mediated Integration (REMI) Mutagenesis.201-210. https://doi.org/10.1385/1-59745-144-4:201