DNA和蛋白质去磷酸化操作流程

蛋白质和DNA去磷酸化

去磷酸化指的是水解去除磷酸(PO43−)基团的过程。在对蛋白质或DNA去磷酸化时,需要使用酶或水解酶切割酯键。例如,磷酸酶可将磷酸单酯水解为磷酸根离子和带有游离羟基(OH)基团的分子,从而去除磷酸基团。

去磷酸化操作流程

1.利用小牛肠碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化

材料

牛肠碱性磷酸酶(货号 P4978)
10X CIP缓冲液(货号C3225)
1 M NaCl
0.5 M Tris-HCl,pH 7.9,25°C
0.1 M MgCl2
0.01 M二硫苏糖醇

存储缓冲液

10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl2
0.1 mM ZnCl2
50%甘油

操作流程

  1. 1X CIP缓冲液溶解DNA(0.5 µg DNA/10 µL)。
  2. 对于5’突出的粘末端DNA加入0.1单位/皮摩尔的CIP;对于3'突出的粘末端或布路姆试剂加入1单位/皮摩尔。
  3. 在37℃孵育60分钟。
  4. 苯酚/氯仿2货号P3803或P2069)萃取或凝胶纯化DNA。*
  5. 乙醇沉淀法恢复DNA。2

*注意:苯酚提取或凝胶纯化后无需再热灭活。

热灭活:对于牛肠酶,在5毫摩尔/升的乙二胺四乙酸下,加热至75℃10分钟,可使95%以上的活性失活。 注意:大肠杆菌的碱性磷酸酶比牛肠酶在高温下更稳定,也更耐热灭活。

参考文献

1.
MÖSSNER E, BOLL M, PFLEIDERER G. 1980. Purification of Human and Bovine Alkaline Phosphatases by Affinity Chromatography. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 361(1):543-550. http://dx.doi.org/10.1515/bchm2.1980.361.1.543
2.
Sambrook Jea. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. p 5.72, 6.22-6.47 and E.3-E.13.. Cold Spring Harbor Laboratory.

2.利用虾碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化

虾碱性磷酸酶(货号A2237)以50%甘油的溶液形式提供,其中含有25mM Tris-HCl (pH 7.6)、1mM MgCl2和0.1mM ZnCl2

可采用含5 mM MgCl2的0.05 M Tris-HCl (pH 8.5)配制稀释液。

在0.05 M Tris-HCl、5 mM MgCl2、pH 8.5条件下进行去磷酸化。

热灭活:去磷酸化反应后,再升温至60℃15分钟即可使酶失活。

参考文献

1.
Olsen RL, Øverbø K, Myrnes B. 1991. Alkaline phophatase from the hepatopancreas of shrimp (Pandalus borealis): A dimeric enzyme with catalytically active subunits. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 99(4):755-761. http://dx.doi.org/10.1016/0305-0491(91)90139-5
2.
Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Cold Spring Harbor, New York: 参考文献.
3.
Takanami M. 1967. Analysis of the 5?-terminal nucleotide sequences of ribonucleic acids. Journal of Molecular Biology. 23(2):135-148. http://dx.doi.org/10.1016/s0022-2836(67)80022-6

3.利用牛肠碱性磷酸酶对蛋白进行去磷酸化

操作流程:将100单位碱性磷酸酶(货号P0114)与400μg蛋白在5 mM Tris(pH 7.9)、10 mM NaCl、1 mM MgCl2和0.1mM DTT条件下30°C孵育30分钟。

1.
Labugger R, Organ L, Collier C, Atar D, Van Eyk JE. 2000. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation. 102(11):1221-1226. http://dx.doi.org/10.1161/01.cir.102.11.1221

参考文献

1.
Labugger R, Organ L, Collier C, Atar D, Van Eyk JE. 2000. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation. 102(11):1221-1226. http://dx.doi.org/10.1161/01.cir.102.11.1221