Guida alla risoluzione dei problemi in HPLC

Come identificare, isolare e correggere i problemi più comuni in HPLC

Benché lo sviluppo delle metodiche HPLC sia stato migliorato dall’evoluzione della tecnologia delle colonne e della strumentazione, i problemi non mancano. Questa guida propone un approccio operativo orientato a isolare, identificare e correggere diversi problemi ricorrenti in HPLC

I componenti principali di un sistema per HPLC sono gli stessi, che si impieghi un sistema modulare o una singola unità più complessa. I problemi che hanno ripercussioni sulle prestazioni dell’intero sistema possono verificarsi in ognuno dei componenti principali. Prendiamo in esame qui alcuni dei problemi più comuni. Le soluzioni a questi problemi vengono presentate in tabelle di facile impiego.

Come individuare i problemi in HPLC
Come prevenire i problemi alla fase mobile
Come individuare i problemi della pompa
L’iniettore e i solventi di iniezione
La protezione delle colonne
Come ottenere il massimo dalla propria colonna analitica
Come risolvere i problemi al rilevatore

Termostato della colonna e registratore
Come mantenere dei record accurati
Indice analitico dei problemi
Problemi in HPLC, cause e rimedi
Come ripristinare le prestazioni della colonna
Come prevenire o risolvere i problemi più comuni a livello di raccordi
Una selezione di prodotti per la protezione della colonna

Come individuare i problemi in HPLC

In un sistema HPLC, i problemi possono avere svariate origini. Occorre innanzitutto identificare il problema, per poi isolare la fonte del problema stesso.

Per determinare quale(i) dei componenti sia la causa del problema, potete fare ricorso alla Tabella 1 Seguendo un processo per esclusione, è possibile identificare la causa specifica e correggere il problema.

Volete passare da un sistema HPLC ad un sistema UHPLC? Cominciate calcolando il risparmio in termini di tempo di corsa e di consumo di solvente che potete realizzare passando dall’HPLC all’UHPLC.

Come prevenire i problemi della fase mobile

Spesso una scarsa sensibilità e linee di base in salita, rumore o disturbi del segnale (spike) nel cromatogramma possono essere dovuti alla fase mobile. I contaminanti presenti nella fase mobile costituiscono un problema particolarmente spinoso se si opera in eluizione a gradiente. La linea di base può salire e, man mano che il livello del componente contaminato aumenta, possono apparire picchi spuri.

Nelle analisi cromatografiche a fase inversa, l’acqua costituisce la fonte di contaminazione più comune. Nella formulazione delle fasi mobili occorre utilizzare sono acqua distillata o acqua deionizzata di purezza elevata. Tuttavia, molti deionizzatori comuni introducono contaminanti organici nell’acqua. Per rimuovere questi contaminanti occorre passare l’acqua deionizzata attraverso una colonna a carbone attivo o una colonna preparativa C18.

Utilizzare esclusivamente solventi, sali, reagenti di coppia ionica e modificatori acidi e basici di grado HPLC. La pulizia di solventi di qualità inferiore richiede tempo e spesso rimangono livelli di contaminanti in tracce. Quando si impiegano rilevatori ultravioletti o a fluorescenza ad elevata sensibilità, questi contaminanti in tracce possono essere causa di problemi.

Dato che molti tamponi acquosi stimolano la crescita di batteri o di alghe, tali soluzioni vanno preparate di fresco e vanno filtrate (filtri di grado 0,2 μm or 0,45 μm) prima dell’uso. La filtrazione permette di rimuovere anche particelle che potrebbero determinare una linea di base rumorosa o intasare la colonna. La crescita di microorganismi può essere evitata mediante aggiunta alle soluzioni tampone acquose di 100 ppm di azoturo di sodio. In alternativa, i tamponi possono anche essere miscelati con il 20% o più di un solvente organico come l’etanolo o l’acetonitrile.

Per evitare la formazione di bolle nel sistema, degassare la fase mobile. Generalmente, la soluzione migliore è quella di utilizzare un degassatore in linea, ma, se la fase mobile non contiene componenti volatili, è anche possibile passare un flusso di elio attraverso i solventi (sparging).

Utilizzare i reagenti di coppia ionica con cautela. La lunghezza ottimale della catena e la concentrazione del reagente devono essere determinate ad ogni analisi. Le concentrazioni possono scendere fino ad un minimo di 0,2 mM o arrivare fino ad un massimo di 150 mM e anche più. In linea generale, aumentare la concentrazione e la lunghezza della catena aumenta i tempi di ritenzione. Concentrazioni elevate (> 50%) di acetonitrile o di alcuni altri solventi organici possono far precipitare i reagenti di coppia ionica. Inoltre, alcuni sali di reagenti di coppia ionica sono insolubili in acqua e precipiteranno. Tutto ciò si può evitare utilizzando, al posto dei tamponi contenenti potassio, tamponi contenenti ione sodio in presenza di acidi solfonici a catena lunga (p.es. dodecilsolfato di sodio).

Quando si è intenzionati a recuperare un composto da sottoporre a un supplemento di analisi, può essere utile ricorrere a modificatori acidi o basici volatili come la trietilammina (TEA) o l’acido trifluoroacetico (TFA). Questi modificatori permettono anche di evitare i problemi associati all’uso di reagenti di coppia ionica. Essi possono essere aggiunti al tampone in concentrazioni che vanno da 0,1 ad 1,0% per il TEA e da 0,01 a 0,15% nel caso del TFA. Per alcuni composti, un aumento della concentrazione può migliorare la forma del picco, modificando però i tempi di ritenzione.

Riciclare la fase mobile utilizzata per le separazioni isocratiche è diventato un modo sempre più diffuso di ridurre i costi legati ai solventi, al loro smaltimento e al tempo necessario alla preparazione della fase mobile. Un apparato per il recupero del solvente utilizza una valvola di commutazione controllata da un microprocessore, per indirizzare il flusso di solvente allo scarico allorché viene rilevato un picco. Quando la linea di base torna sotto la soglia predefinita, il solvente non contaminato viene nuovamente convogliato al serbatoio del solvente.

Figura A. Componenti di un sistema HPLC

Come individuare i problemi della pompa

La pompa deve poter alimentare la colonna con un flusso costante di solvente operando in un ampio spettro di condizioni. I sistemi di pompaggio per HPLC incorporano modelli di pompa a pistone singolo, a pistone doppio, a siringa o a membrana.

I problemi dovuti alla pompa sono in genere facili da identificare e da risolvere. Alcuni dei sintomi più comuni sono dati da tempi di ritenzione variabili, linee di base rumorose o spike nel cromatogramma. Perdite a livello dei raccordi o delle guarnizioni della pompa determinano un risultato cromatografico scadente. Un deposito di sali a livello dei raccordi della pompa è un segnale certo di una perdita. È opportuno quindi far circolare nel sistema, ogni giorno, un tampone salino preparato con acqua deionizzata di fresco. Per identificare e porre rimedio a problemi specifici riconducibili all’apparecchiatura, fare riferimento alle sezioni relative alla risoluzione dei problemi e alla manutenzione presenti nel manuale operativo. Le guarnizioni della pompa devono essere sostituite periodicamente. É consigliabile svolgere una manutenzione su base regolare piuttosto che attendere il verificarsi di un problema.

L’iniettore e i solventi di iniezione

L’iniettore introduce con rapidità il campione nel sistema, con un'interruzione minima del flusso di solvente. Comunemente, i sistemi HPLC utilizzano iniettori con valvola di iniezione a loop variabile o loop fisso oppure iniettori a microsiringa. Questi dispositivi possono essere attivati manualmente, in modo pneumatico o elettricamente.

I problemi di tipo meccanico che riguardano l’iniettore (p.es. perdite, intasamento dei tubi capillari, guarnizioni consumate) sono di facile individuazione. Utilizzare un filtro precolonna per prevenire l’intasamento dei setti della colonna dovuto al deterioramento della guarnizione dell’iniettore. Altri problemi, quali le iniezioni non riproducibili, sono più difficili da risolvere.

Altezza variabile dei picchi, sdoppiamento dei picchi, picchi ampi, possono dipendere da loop di campionamento non completamente riempiti, incompatibilità del solvente di iniezione con la fase mobile o scarsa solubilità del solvente. Ogniqualvolta sia possibile, disciogliere e iniettare i campioni nella fase mobile. Altrimenti, assicurarsi che il solvente di iniezione abbia una forza eluente inferiore a quella della fase mobile (Tabella 3). Occorre tenere presente che, per il lavaggio della siringa, alcuni campionatori automatici utilizzano soluzioni a parte. Assicurarsi che la soluzione di lavaggio sia compatibile con la fase mobile e più debole di quella. Ciò è particolarmente importante quando si passa da analisi in fase inversa ad analisi in fase normale.

La protezione delle colonne

Benché non siano parte integrante della maggior parte delle apparecchiature, filtri d’ingresso per la fase mobile, pre-iniettori, filtri precolonna e colonne di guardia permettono di ridurre considerevolmente i problemi connessi a separazioni complesse. Consigliamo di filtrare tutti i campioni mediante filtri da siringa da 0,45 μm o 0,2 μm. Raccomandiamo vivamente l’impiego di colonne di guardia.

Filtri e colonne di guardia evitano che particelle e composti fortemente ritenuti si accumulino sulla colonna analitica. La durata di utilizzo di questi prodotti a perdere dipende dalla composizione della fase mobile, dalla purezza del campione, dal pH ecc. Via via che questi dispositivi vengono contaminati o ostruiti dalle particelle, la pressione aumenta e i picchi si allargano o si sdoppiano. A titolo di esempio, la Figura B illustra una situazione nella quale i vantaggi nell’impiego di una colonna di guardia risultano evidenti. 

Figura B. Le colonne Supleguard prolungano la durata di esercizio delle vostre colonne analitiche.

Come ottenere il massimo dalla propria colonna analitica

Che la colonna contenga una fase legata inversa o una fase normale, un letto di resina a scambio ionico, che sia una colonna per cromatografia di affinità, cromatografia di interazione idrofobica, cromatografia ad esclusione dimensionale o che la colonna sia impaccata con resina o con silice, Il problema più comune associato alle colonne analitiche è il deterioramento. Picchi mal definiti, sdoppiamento dei picchi, presenza di spalle, perdita di risoluzione, riduzione dei tempi di ritenzione, contropressione elevata, sono tutti sintomi di un deterioramento della colonna, che segnalano un accumulo di contaminanti sul setto poroso o all’ingresso della colonna, oppure la presenza di vuoti, canali o di uno schiacciamento nel letto di impaccamento.

Nelle colonne a maggior efficienza, il fenomeno del deterioramento è più evidente. Per esempio, un materiale di impaccamento da 3 micron trattenuto da setti porosi da 0,5 micron è più suscettibile di provocare un’ostruzione rispetto ad un materiale di impaccamento da 5 o 10 micron trattenuto con setti porosi da 2 o più micron. Per far lavorare al meglio ogni colonna è di fondamentale importanza proteggere la colonna preparare il campione in maniera adeguata.

Il sovraccarico della colonna può determinare picchi mal definiti e altri problemi.

Capacità tipica di una colonna

La capacità di una colonna dipende da molteplici fattori; ad ogni modo, i valori di riferimento per le quantità totali di analiti che una colonna può trattare sono:

Tipo di colonna	Dimensioni della colonna	Capacità della colonna
Colonna analitica:	25 cm x 4,6 mm	< 500 μg
Colonna semi-preparativa	25 cm x 10 mm	100 mg
Colonna preparativa	25 cm x 21 mm	<500 mg

Come risolvere i problemi del rivelatore

I problemi del rivelatore rientrano in due categorie: problemi di natura elettrica e problemi meccanici/ottici. Quando si manifesta un problema elettrico è necessario contattare il produttore dello strumento. I problemi di natura meccanica o di natura ottica sono riconducibili alla cella di flusso. I problemi connessi al rivelatore sono, tra gli altri, le perdite, le bolle d’aria e la contaminazione della cella di flusso. Come conseguenza, nei cromatogrammi si producono spike e rumore di fondo o la sensibilità del cromatografo diminuisce.

Alcune celle — specialmente quelle in uso nei rivelatori a indice di rifrazione — sono sensibili alla pressione. Velocità di flusso o contropressioni che superano le raccomandazioni del produttore possono causare la rottura della finestra della cella. Lampade esaurite o difettose, così come tempi di risposta del rilevatore, amplificazione o attenuazione non corretti, ridurranno la sensibilità e l’altezza dei picchi. I problemi possono anche derivare dall’inversione delle connessioni dei cavi o dalla loro difettosità.

Termostato della colonna e registratore

Si tratta di componenti che raramente sono causa di problemi per il sistema. Verranno presi in esame nella tavola di risoluzione dei problemi (Tabella 1).

Conservare registrazioni accurate

La maggior parte dei problemi non si verificano da un giorno all’altro, ma si sviluppano gradualmente. Per identificare e risolvere molti dei problemi che si incontrano in HPLC è quindi fondamentale tenere traccia dei fatti salienti con la massima cura

Sottoponete a valutazione ogni colonna ricevuta, al momento in cui la si riceve e, in seguito, ad intervalli regolari. Per tenere sotto controllo le prestazioni del vostro sistema, mantenete una registro scritto dell’efficienza di una colonna, delle fasi mobili utilizzate con essa, della corrente della lampada, del funzionamento della pompa ecc.

Dati e informazioni accuratamente registrati aiutano inoltre a evitare gli errori, come quello di introdurre dell’acqua in una colonna di silice o far precipitare un tampone nel sistema per un’aggiunta eccessiva di solvente organico. Molti analisti di laboratorio modificano il proprio sistema HPLC, in un modo o nell’altro. Conservare una documentazione attendibile è il modo migliore di assicurarsi che una modifica al sistema non sia causa di problemi. Per problemi relativi alle pompe, ai rivelatori, ai campionatori automatici e ai sistemi di gestione dei dati, fate riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi presente nel manuale del vostro strumento.

Indice analitico dei problemi in HPLC

Problema	N° problema
deriva della linea di base	12
rumore di fondo, irregolare	14
rumore di fondo, regolare	13
Contropressione della colonna
più alta del solito	4
più bassa del solito	3
picchi fantasma	19
Forme dei picchi, non corrette
picchi ampi	15
fronting del picco	10
picchi arrotondati	11
picchi sdoppiati	7
picchi scodati	8
picchi scodati, picco iniziale e successivi	9
Picchi
variazione di altezza	16
picchi assenti	2
picchi negativi	18
nessun picco	1
picchi non risolti	6
tempi di ritenzione, variabili	5
cambiamento di selettività	17

Tabella 1. Problemi di HPLC, cause possibili e soluzioni

Problema n° 1: Assenza di picchi/Picchi molto piccoli

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Lampada del rilevatore spenta. Cavo che collega rilevatore e integratore, o registratore, rotto o allentato. Assenza di flusso della fase mobile. Assenza del campione/campione deteriorato/campione sbagliato. Parametri del rilevatore o del registratore impostati su valori troppo elevati.	Accendere la lampada. Verificare le connessioni elettriche e i cavi “Assenza di flusso” (Problema n° 2). Assicurarsi che le fiale del campionatore automatico contengano liquido sufficiente e che non ci siano bolle d’aria nel campione. Sottoporre a valutazione l’operatività del sistema con un nuovo standard così per avere conferma che sia il campione la causa del problema. Verificare le impostazioni dell’attenuazione e del gain. Verificare le condizioni della lampada. Se necessario, impostare l’azzeramento automatico.

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Problema n° 2: Assenza di flusso

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Pompa spenta. Flusso interrotto/ostruito. Perdita. Aria intrappolata nella testa della pompa. (Rivelata da fluttuazioni di pressione.)	Avviare la pompa. Controllare il livello della fase mobile nel serbatoio/nei serbatoi. Controllare il flusso lungo l’intero circuito del cromatografo. Verificare che non ci siano ostruzioni o bolle d’aria nel loop del campione. Assicurarsi che i componenti della fase mobile siano miscibili tra loro e che la fase mobile sia stata degassata adeguatamente. Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Scollegare il tubo della colonna di guardia (se presente) o quello di ingresso nella colonna analitica. Verificare il flusso. Spurgare la pompa a flusso elevato (p.es., 5-10 mL/min.), adescare il sistema, se necessario. (Adescare separatamente la testa di ogni pompa.) Se il sistema è dotato di una valvola di non ritorno, allentarla per permettere all’aria di uscire. Se il problema persiste, flussare il sistema con metanolo o isopropanolo al 100%. Se il problema sussiste ancora, contattare il produttore del sistema.

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Problema n° 3: Pressione assente/più bassa del solito

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Perdita. Flusso della fase mobile interrotto/ostruito. Aria intrappolata nella testa della pompa. (Rivelata da fluttuazioni di pressione) Perdita a livello del raccordo terminale di ingresso della colonna. Aria intrappolata altrove nel sistema. Guarnizione della pompa usurata che causa perdite intorno alla testa della pompa. Valvola di non ritorno difettosa. Guarnizioni della pompa difettose.	Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Controllare il livello della fase mobile nel serbatoio/nei serbatoi. Controllare il flusso lungo l’intero circuito del cromatografo. Verificare che non ci siano ostruzioni o bolle d’aria nel loop del campione. Assicurarsi che i componenti della fase mobile siano miscibili tra loro e che la fase mobile sia stata degassata adeguatamente. Scollegare il tubo della colonna di guardia (se presente) o quello di ingresso nella colonna analitica. Verificare il flusso. Spurgare la pompa a flusso elevato (p.es., 10 mL/min.); adescare il sistema, se necessario. (Adescare separatamente la testa di ogni pompa) Se il sistema è dotato di una valvola di non ritorno, allentarla per permettere all’aria di uscire. Ricollegare la colonna e pompare solvente al doppio della velocità di flusso. Se la pressione rimane bassa, verificare la presenza di eventuali perdite a livello di raccordo di ingresso o di raccordo terminale della colonna. Scollegare la colonna di guardia e quella analitica e spurgare il sistema. Ricollegare la/le colonna/e Se il problema persiste, flussare il sistema con metanolo o isopropanolo al 100%. Sostituire la guarnizione. Se il problema persiste, sostituire il pistone della pompa e la guarnizione. Ricostruire o sostituire la valvola. Sostituire le guarnizioni.

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Problema n° 4: Pressione più alta del solito

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Problema a livello di pompa, di iniettore, di filtro in linea o di tubi. colonna di guardia o colonna analitica ostruite.	Rimuovere la colonna di guardia e la colonna analitica dal sistema. Sostituirle con raccordi e tubi con D.I. da 0,010'’ o più in modo da ricollegare l’iniettore al rivelatore Azionare la pompa a 2-5 mL/min. Se la pressione è minima, si veda la causa probabile n° 2. Se la pressione rimane elevata, identificarne la causa rimuovendo sistematicamente gli elementi del sistema, a partire dal rivelatore, passando al filtro in linea e tornando poi alla pompa. Se presente, sostituire il filtro nella pompa. Se presente, rimuovere la colonna di guardia e controllare la pressione. Se necessario, sostituire la colonna di guardia Se la colonna analitica è ostruita, invertirla e flussare la colonna mentre è scollegata dal rivelatore. Se il problema persiste, la colonna potrebbe essere intasata da contaminanti fortemente ritenuti. Utilizzare una procedura di rigenerazione opportuna (Tabella 2). Se il problema continua a sussistere, sostituire il setto d’ingresso o rimpiazzare la colonna.

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Problema n° 5: Tempi di ritenzione variabili

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Perdita. Variazione nella composizione della fase mobile. (Piccoli scostamenti possono determinare variazioni significative nei tempi di ritenzione.) Aria intrappolata nella pompa. (I tempi di ritenzione aumentano e diminuiscono a intervalli irregolari.) Fluttuazioni nella temperatura della colonna (particolarmente evidenti nei sistemi a scambio ionico). Sovraccarico (overloading) della colonna. (Se la massa di soluto iniettata eccede la capacità della colonna, i tempi di ritenzione in genere si riducono.) Solvente del campione incompatibile con la fase mobile. Problema alla colonna. (Non è una causa ricorrente della variazione irregolare dei tempi di ritenzione. In genere, man mano che una colonna si deteriora, i tempi di ritenzione diminuiscono gradualmente)	Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Verificare la preparazione della fase mobile. Se la fase mobile viene miscelata automaticamente secondo proporzioni definite, miscelare a mano e dispensare da un singolo serbatoio. Spurgare l’aria dalla testa della pompa e dalle valvole di non ritorno. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Assicurarsi che la fase mobile sia degassata. Per la colonna, utilizzare un forno di termostatazione affidabile. (Nota: una temperatura della colonna più elevata aumenta l’efficienza della colonna; per risultati ottimali, riscaldare l’eluente prima di introdurlo nella colonna.) Iniettare volumi più piccoli (p.es. 10 μL invece di 100 μL) o iniettare un eguale volume dopo aver diluito il campione 1:10 o 1:100. Regolare la composizione del solvente. Ogni qualvolta sia possibile, iniettare i campioni disciolti nella fase mobile. Per avere conferma che sia la colonna la causa del problema, sostituire la colonna con una colonna nuova dello stesso tipo. In caso la procedura di ripristino della colonna fallisca, eliminare la vecchia colonna.

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Problema n° 6: Perdita di risoluzione

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Fase mobile contaminata/deteriorata (che determina variazioni dei tempi di ritenzione e/o di selettività). Colonna di guardia o colonna analitica ostruite.	Preparare della nuova fase mobile. Rimuovere, se presente, la colonna di guardia e provare a esaminarla. Se necessario, sostituirla. Se la colonna analitica è ostruitainvertirla e flussarla Se il problema persiste, la colonna potrebbe essere intasata da contaminanti fortemente ritenuti. Utilizzare una procedura di rigenerazione adeguata(Tabella 2). Se il problema continua a sussistere, sostituire il setto di ingresso o cambiare colonna.

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Problema n° 7: Picchi sdoppiati

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Contaminazione a livello di ingresso della colonna di guardia o della colonna analitica. Setto poroso parzialmente bloccato. Piccolo spazio vuoto (disomogeneo) all’ingresso della colonna. Solvente del campione incompatibile con la fase mobile.	Rimuovere, se presente, la colonna di guardia e provare a esaminarla. Se necessario, sostituirla. Se la colonna analitica è ostruitainvertirla e flussarla Se il problema persiste, la colonna potrebbe essere intasata da contaminanti fortemente ritenuti. Utilizzare una procedura di rigenerazione adeguata(Tabella 2). Se il problema persiste ancora, il setto poroso di ingresso con tutta probabilità è, almeno in parte, ostruito. Sostituire il setto o rimpiazzare la colonna. Sostituire il setto poroso (vedi sopra). Impaccare nuovamente la parte superiore della colonna con particelle pellicolari che abbiano la stessa funzionalità a livello di fase legata. Continuare a usare la colonna a direzione di flusso invertita. Regolare la composizione del solvente. Ogni qualvolta sia possibile, iniettare i campioni disciolti nella fase mobile.

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Problema n° 8: Picchi scodati alla prima iniezione e nelle iniezioni successive

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	L’analita reagisce con i siti attivi. pH della fase mobile sbagliato. Tipo di colonna sbagliato. Piccolo spazio vuoto (disomogeneo) all’ingresso della colonna. Solvente di iniezione sbagliato.	Per prima cosa, controllare le prestazioni della colonna con una miscela di prova standard per colonne. Se i risultati ottenuti con la miscela di test sono buoni, aggiungere un reagente di coppia ionica o un modificante competitivo acido o basico Regolare il pH. In caso di composti basici, abbassare il pH in genere è sufficiente a rendere più simmetrici ipicchi. Provare con una colonna di altro tipo (p.es. colonna disattivata per composti basici). Vedere Picchi sdoppiati. Quando il campione viene iniettato in un solvente più forte della fase mobile, i picchi possono risultare scodati. Disciogliere il campione nella fase mobile.

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Problema n° 9: Picchi scodati (tailing)

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	La colonna di guardia o la colonna analitica sono contaminate o consumate. La fase mobile è contaminata/deteriorata. Nel campione sono presenti componenti che interferiscono.	Rimuovere, se presente, la colonna di guardia e provare a esaminarla. Se necessario, sostituirla. Se la colonna analitica è fonte di problemi, utilizzare una procedura di rigenerazione adeguata (Tabella 2). Se il problema persiste, sostituire la colonna. Controllare la preparazione della fase mobile. Controllare le prestazioni della colonna con l’uso di standard.

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Problema n° 10: Picchi sovraccarichi (fronting)

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Sovraccarico della colonna. Solvente del campione incompatibile con la fase mobile. La presenza di una spalla o il graduale innalzamento della linea di base prima di un picco principale possono indicare la presenza di un componente ulteriore nel campione.	Iniettare volumi più piccoli (p.es. 10 μL invece di 100 μL). In caso di un caricamento eccessivo di campione, diluire il campione in proporzioni di 1:10 o di 1:100. Regolare la composizione del solvente. Ogni qualvolta sia possibile, iniettare i campioni disciolti nella fase mobile. Prima dell’analisi, flussare la colonna a fase legata polare con 50 volumi di colonna di etil acetato di grado HPLC ad una velocità di flusso pari a 2-3 volte quella standard, quindi con un solvente a polarità media. Per migliorare la risoluzione, aumentare l’efficienza o modificare la selettività del sistema. Se necessario, ricorrere ad un altro tipo di colonna (p.es., passare da una C18 non polare a una fase ciano polare).

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Problema n° 11: Picchi arrotondati (rounded peaks)

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Il rivelatore opera al di fuori del range dinamico lineare. Il valore di gain impostato nel registratore è troppo basso. C’è un sovraccarico della colonna. Interazioni tra analita e colonna. Le costanti temporali del rivelatore e/o del registratore sono impostate su valori troppo alti.	Ridurre il volume di campione e/o la sua concentrazione. Regolare il gain. Iniettare volumi più piccoli (p.es. 10 μL invece di 100 μL) o iniettare un volume uguale dopo aver diluito il campione 1:10 o 1:100. Modificare la forza del tampone, il pH o la composizione della fase mobile. Se necessario, innalzare la temperatura della colonna o cambiare tipo di colonna. (Un esame della struttura del soluto può essere d’aiuto nel prevedere le interazioni.) Ridurre al minimo i valori impostati o settarli a valori oltre i quali non si osservano ulteriori miglioramenti.

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Problema n° 12: Deriva della linea di base

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Fluttuazioni nella temperatura della colonna. (Anche piccole variazioni possono causare salite e discese cicliche della linea di base; il più delle volte ne risentono i rivelatori a indice di rifrazione e quelli a conducibilità, i rivelatori UV ad elevata sensibilità o a rivelazione fotometrica indiretta.) Fase mobile non omogenea. (Deriva riconducibile in genere ad una assorbanza elevata, piuttosto che ad un andamento ciclico delle fluttuazioni di temperatura) Accumulo di contaminanti o di aria nella cella del rilevatore. Linea di scarico intasata a valle del rilevatore. (Pressioni elevate causano la rottura della finestra della cella, con conseguente rumorosità della linea di base.) Problemi di miscelazione della fase mobile o variazioni della velocità di flusso. Equilibrazione della colonna troppo lenta, in particolare quando la composizione della fase mobile viene modificata. Fase mobile contaminata, deteriorata o preparata con prodotti chimici di scarsa qualità. Sostanze presenti nel campione soggette a una forte ritenzione (k’ elevata) possono eluire come picchimolto appiattiti ed apparire come una linea di base che sale. (Nel caso di analisi in gradiente il problema può accentuarsi.) Rivelatore UV non regolato sul massimo di assorbanza ma sulla pendenza della curva.	Controllare la temperatura della colonna e quella della fase mobile, utilizzare uno scambiatore di calore posto prima del rivelatore. Usare solventi di grado HPLC, sali di purezza elevata e additivi. Prima dell’uso, degassare la fase mobile; durante l’uso, utilizzare un flusso di elio per eliminare i gas disciolti nel solvente. Flussare nella cella metanolo o un altro solvente forte. Se necessario, pulire la cella con HNO3 1N (mai con HCl; non usare mai acido nitrico con i tubi o i raccordi in PEEK). Sturare la linea o sostituire il tubo di scarico. Consultare il manuale del rivelatore per sostituire la finestra della cella. Correggere la composizione o la velocità di flusso dell’eluente. Per evitare problemi, monitorare regolarmente la composizione e il flusso dell’eluente. Prima dell’analisi, flussare la colonna con un solvente di forza media, poi far correre 10 - 20 volumi di colonna della nuova fase mobile. Controllare con scrupolo la preparazione della fase mobile e i materiali utilizzati. Usare una precolonna. Se necessario, flussare con un solvente forte tra un’iniezione di campione e l’altra oppure periodicamente nel corso dell’analisi. Modificare la lunghezza d’onda di lettura al valore di massima assorbanza UV.

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Problema n° 13: Rumore di fondo (oscillazioni regolari)

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Aria nella fase mobile, nella cella del rivelatore o nella pompa. Pulsazioni della pompa. Miscelazione della fase mobile insufficiente. Effetto temperatura: colonna ad alta temperatura, rivelatore non riscaldato. Altro strumento elettronico sulla linea elettrica del cromatografo. Perdita.	Degassare la fase mobile. Flussare il cromatografo con eluente per allontanare l’aria dalla cella del rivelatore o dalla pompa. Introdurre nel sistema un attenuatore di pulsazioni. Miscelare la fase mobile manualmente o utilizzare un solvente meno viscoso. Ridurre il differenziale o aggiungere uno scambiatore di calore per l’eluente. Isolare la colonna, il rivelatore e il registratore per determinare se l’origine del problema è eterna al sistema cromatografico. Intervenire di conseguenza. Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa.

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Problema n° 14: Rumore di fondo (oscillazioni irregolari)

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Perdita. Fase mobile contaminata, deteriorata o preparata con prodotti chimici di scarsa qualità. Elettronica del rivelatore o del registratore. Aria intrappolata nel cromatografo. Bolle d’aria nel rivelatore. Cella del rilevatore contaminata. (Anche limitate quantità di contaminante possono essere causa dei disturbi.) Lampada del rivelatore indebolita. Perdite di silice o del materiale di impaccamento dalla colonna.	Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Controllare con scrupolo la preparazione della fase mobile e i materiali utilizzati. Isolare elettronicamente il rivelatore e il registratore. Consultare il manuale di istruzioni per risolvere il problema. Flussare il sistema con un solvente forte. Spurgare il rivelatore. Installare un regolatore di contropressione a valle del rivelatore. Consultare il manuale dello strumento, specialmente in caso di rivelatori RI (una contropressione eccessiva può determinare la rottura della cella di flusso). Pulire la cella. Sostituire la lampada. Sostituire la colonna e pulire il sistema.

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Problema n° 15: Picchi larghi

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	La composizione della fase mobile è cambiata. Il flusso della fase mobile è troppo basso. Perdite (specialmente tra colonna e rivelatore). Impostazione dei parametri del rivelatore non corretta. Effetti extra-colonna: a. Colonna sovraccarica b. Tempo di risposta del rivelatore troppo lungo o volume della cella troppo grande. c. Tubi tra colonna e rivelatore troppo lunghi o di diametro interno eccessivo. d. Tempo di risposta del registratore troppo alto. Concentrazione del tampone troppo bassa. Colonna di guardia contaminata o deteriorata. Colonna analitica contaminata o deteriorata. Spazio vuoto all’ingresso della colonna. Picco che indica la presenza di due o più analiti scarsamente risolti. Temperatura della colonna troppo bassa.	Preparare della nuova fase mobile. Regolare la velocità di flusso Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Regolare i parametri impostati. a. Iniettare volumi più piccoli (p.es. 10 μL invece di 100 μL) o iniettare volume uguale dopo aver diluito il campione 1:10 o 1:100. b. Ridurre il tempo di risposta o usare una cella più piccola. c. Usare un pezzo di tubo di lunghezza adeguata e diametro interno di 0.007-0.010". d Ridurre il tempo di risposta. Aumentare la concentrazione. Sostituire la colonna di guardia. Sostituire la colonna con una nuova colonna dello stesso tipo. Se con la nuova colonna non si ottengono dei picchi stretti, flussare la vecchia colonna (Tavola 2) e riprovare. Sostituire la colonna oppure aprire il terminale di ingresso della colonna e riempire la testa della colonna. Cambiare il tipo di colonna per migliorare la separazione dei picchi. Aumentare la temperatura. Non superare i 75 °C a meno di indicazioni specifiche del produttore della colonna.

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Problema n° 16: Variazione nell’altezza di uno o più picchi

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Deterioramento di uno o più componenti del campione o variazione nell’attività della colonna. Perdite, specialmente tra la porta di iniezione e l’ingresso della colonna. (In questo caso, anche la ritenzione subisce variazioni.) Volume del campione non costante. Impostazione dei parametri del rivelatore non modificata. Lampada del rivelatore indebolita. Contaminazione nella cella del rilevatore.	Per avere conferma che sia il campione la causa del problema, utilizzare un campione o uno standard preparati di fresco. Se alcuni picchi, o tutti, continuano ad essere più piccoli del previsto, sostituire la colonna. Se la nuova colonna produce un miglioramento nell’analisi, provare a ripristinare la vecchia colonna seguendo una procedura adeguata (Tabella 2). Se le prestazioni del cromatografo non migliorano, eliminare la vecchia colonna. Controllare se ci sono raccordi allentati nel sistema. Controllare che non ci siano perdite, depositi di sale o rumori insoliti a livello della pompa. Se necessario, cambiare le guarnizioni della pompa. Assicurarsi che il volume dei campioni sia costante. In caso di loop del campione a volume fisso, utilizzare un volume pari a 2-3 volte il volume fisso per essere sicuri che il loop sia riempito completamente. Assicurarsi che le fiale del campionatore automatico contengano liquido sufficiente e che non ci siano bolle d’aria nel campione. Controllare che non ci sia aria negli iniettori a siringa. Nei sistemi che prevedono un lavaggio o un flussaggio, assicurarsi che la soluzione di lavaggio non precipiti i componenti del campione. Controllare i parametri impostati Sostituire la lampada. Pulire la cella.

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Problema n° 17: Modificazioni della selettività

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Aumento o diminuzione della forza ionica del solvente, del suo pH o della concentrazione di additivi nel solvente (riguarda soprattutto i soluti ionici). Colonna sostituita con una nuova colonna la cui selettività è diversa rispetto alla precedente. Campione iniettato nel solvente sbagliato o in una quantità eccessiva (100-200 μL) di solvente forte. Cambiamento della temperatura della colonna.	Controllare la preparazione della fase mobile. Assicurarsi che l’impaccamento della colonna sia lo stesso. Per analisi riproducibili, usare lo stesso tipo di colonna. Appurare se il cambiamento è avvenuto gradualmente. In tal caso, la fase legata potrebbe essere stata rilasciata dalla colonna per idrolisi. L’attività della colonna potrebbe essere cambiata o la colonna potrebbe essere contaminata. Regolare la composizione del solvente. Ogni qualvolta sia possibile, iniettare i campioni disciolti nella fase mobile. Regolare la temperatura Se ce n’è bisogno, utilizzare il forno della colonna per mantenere una temperatura costante.

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Problema n° 18: Picchi negativi

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Cavi del registratore invertiti. Indice di rifrazione del soluto inferiore a quello della fase mobile (rivelatore RI). Il solvente del campione e la fase mobile hanno composizioni significativamente differenti (“vacancy peaks”). Alle lunghezze d’onda UV la fase mobile assorbe più dei componenti del campione.	Controllare e, se necessario, invertire la polarità. Utilizzare una fase mobile con indice di rifrazione più basso o invertire la polarità dei cavi del registratore. Regolare o cambiare il solvente del campione. Ogni qual volta sia possibile, disciogliere il campione direttamente nella fase mobile. a. Quando si usa un rivelatore UV indiretto, invertire la polarità o b. Cambiare lunghezza d’onda UV oppure usare una fase mobile che non assorbe alla lunghezza d’onda prescelta.

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Problema n° 19: Picchi fantasma

Problema	Causa probabile	Soluzioni/Commenti
	Contaminazione nell’iniettore o nella colonna. Nel campione è presente un analita che eluisce in ritardo (il picco è, in genere, largo).	Flussare l’iniettore tra un’analisi e la successiva (una buona consuetudine). Se necessario, far correre nella colonna un solvente forte per rimuovere i composti ad eluizione tardiva. Nelle analisi a gradiente, prevedere uno step di lavaggio finale per rimuovere i composti ritenuti fortemente. a. Controllare la preparazione del campione. b. Prevedere un gradiente (discontinuo) per eluire velocemente il componente.

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Raccomandazioni ulteriori

Raccomandiamo innanzitutto di fare riferimento alle sezioni “manutenzione” e “risoluzione dei problemi” del manuale dello strumento. I sistemi HPLC moderni sono spesso dotati di funzionalità di autodiagnostica in grado di aiutare a identificare la parte dello strumento interessata dal problema. Per problemi di difficile soluzione dovuti alla colonna o riconducibili alla vostra specifica analisi, vi invitiamo a contattare il Servizio Tecnico Supelco.

La parte conclusiva di questa guida descrive le procedure per ripristinare le prestazioni di una colonna a seguito di perdita di risoluzione, ritenzione o selettività, fornisce suggerimenti su come prevenire o risolvere i problemi di hardware legati alla colonna e presenta una selezione di prodotti per la protezione delle colonne disponibili sul catalogo Supelco. Sul nostro catalogo potete prendere visione della gamma completa di accessori in grado di prolungare la vita delle colonne o, più in generale, di semplificare o migliorare le vostre analisi HPLC o FPLC^®.

Per finire, potete contattarci telefonicamente per richiedere materiale di approfondimento in merito ai nostri prodotti per HPLC o FPLC, o potete utilizzare il nostro servizio ChromFax per avere accesso, senza costi e senza attese, a tutta la nostra letteratura tecnica.

Ripristinare le prestazioni della vostra colonna

Le procedure che seguono dovrebbero essere in grado di rigenerare una colonna le cui prestazioni si siano deteriorate a causa di campioni contaminati.

Scollegare la colonna e ricollegarla in senso inverso. Collegarla alla pompa, ma non al rivelatore. Seguire la procedura di flussaggio adeguata tra quelle presenti nellatabella qui sotto, impostando una velocità di flusso tale da determinare nella colonna una contropressione di 1500-4500 psi e comunque mai più elevata della pressione massima raccomandata dal manuale di istruzioni del produttore. Se si dispone di una colonna SUPELCOSIL, sottoporre ad analisi con la miscela di prova nelle condizioni riportate nella scheda tecnica. I valori di efficienza, simmetria e capacità dovrebbero differire di non più del 10-15% dai valori riportati nella scheda di prova. In caso contrario, reimpaccare l’ingresso della colonna o sostituirla.

Nota bene: i volumi riportati nella Tabella 2 sono riferiti a colonne da 25 cm x 4,6 mm di diametro interno (D.I.), il cui volume è pari a 4,15 mL. Nel caso in cui si ripristini una colonna con D.I. di 4,6 mm più lunga o più corta rispetto a 25 cm, moltiplicare tutti i valori volumetrici della Tabella 2 per un fattore dato dal rapporto tra la lunghezza della colonna usata, in cm, e quella di riferimento, lunga 25 cm (p.es., per una colonna di 15 cm il fattore di proporzionalità è 15/25, ovvero 0,6 volte i volumi riportati in Tabella 2). Nel caso in cui si ripristini una colonna lunga 25 cm avente D.I. diverso da 4,6 mm, moltiplicare tutti i valori di volume della Tabella 2 per un fattore dato dal rapporto tra il quadrato del D.I. della colonna, in mm, e (4,6)² (p.es., per una colonna di D.I. pari a 3,2 mm il fattore di proporzionalità è: (3,2)²/(4,6)² = 10,24/21,16 = 0,48 ‒ da moltiplicare per i valori della Tabella 2).

Tabella 2Procedure di ripristino della colonna

Colonna HPLC: Flussare con: 50 mL di esano 50 mL di cloruro di metilene 50 mL di 2-propanolo 50 mL di metanolo 25 mL di cloruro di metilene 25 mL di fase mobile Valutate le prestazioni della colonna nelle condizioni specificate dal produttore. Nota bene: Per rigenerare una colonna di silice disattivata, si consideri anche Soluzione di rigenerazione delle colonne di silice.	Colonna SUPELCOSIL LC-PCN A. Per rimuovere le proteine Flussare con 10 volumi di colonna di acetonitrile:acqua, 50:50, contenenti lo 0,1% di acido trifluoroacetico. B. Per rimuovere il TCA Flussare con 10 volumi di colonna di acqua distillata (regolare il pH a 2,5 con H3PO4), poi con 10 volumi di colonna ciascuno di: acqua (per rimuovere i sali) metanolo (per rimuovere l’acqua) metanolo/cloruro di metilene, 50:50 (una soluzione di lavaggio di uso generale) metanolo Se le prestazioni della colonna non sono ancora accettabili, preparare il tampone della fase mobile ad una concentrazione 10X rispetto a quanto usato per l’analisi e ricircolare nella colonna per una notte.* Riequilibrare la colonna con la fase mobile ad una concentrazione del tampone normale e valutare nuovamente le prestazioni della colonna. *Agire con cautela: con alcune tipologie e/o concentrazioni di tampone, un incremento della concentrazione pari a 10 volte può causare precipitazione.
Colonna a fase inversa a base di silice (colonne alchiliche [C8, C18 ecc.], feniliche o bifeniliche, colonna SUPELCOSIL LC-PAH A. Campioni idrosolubili - Flussare con: Flussare con acqua distillata calda (60 °C) 50 mL di metanolo 50 mL di acetonitrile 25 mL di metanolo 25 mL di fase mobile Valutare le prestazioni della colonna A. Campioni non idrosolubili - Flussare con: 50 mL di 2-propanolo 50 mL di cloruro di metilene 50 mL di esano 25 mL di isopropanolo 25 mL di fase mobile Valutare le prestazioni della colonna	Colonne a scambio ionico a base di silice (scambio anionico o cationico forte o debole) La maggior parte delle analisi con sistemi a scambio ionico impiegano fasi mobili ioniche. I composti che possono influire sulle prestazioni della colonna sono, in genere, insolubili o poco solubili in acqua. La procedura che segue dovrebbe essere sufficiente a rimuovere questi composti. Flussare con: 50 mL di acqua distillata calda (40-60 °C) 50 mL di metanolo 50 mL di acetonitrile 25 mL di cloruro di metilene 25 mL di metanolo 25 mL di fase mobile Valutare le prestazioni della colonna
Colonna a fase legata polare (colonne a fase ammino, ciano o diolo o colonne chirali di tipo Pirkle) Per una colonna utilizzata in modalità a fase inversa (p.es. fase mobile di tipo solvente organico/tampone acquoso), seguire la stessa procedura di lavaggio delle colonne a fase inversa a base di silice. Per una colonna utilizzata con fasi mobili non acquose, seguire la procedura che segue. Flussare con: 50 mL di cloroformio 50 mL di metanolo 50 mL di acetonitrile 25 mL di cloruro di metilene 25 mL di metanolo 25 mL di fase mobile Valutare le prestazioni della colonna	Colonne a base di silice per RPLC di proteine e peptidi Seguire il protocollo indicato per le colonne a fase inversa a base di silice. In alternativa, procedere con una o più iniezioni di 100 μL di trifluoroetanolo (determinare il numero esatto di iniezioni valutando ad ogni iniezione le prestazioni della colonna). Valutare le prestazioni della colonna

Tabella 3Proprietà dei solventi organici usati comunemente in HPLC • Valori tipici

Solvente	Polarità	Miscibilità con acqua	Valore limite UV	Indice di rifrazione a 20 °C	Forza del solvente ,∈o (silice)	Viscosità a 20 °C, cP
Esano	non polare	no	200	1,375	0	0,33
Isoottano	↓	no	200	1,391	0,01	0,5
tetracloruro di carbonio	↓	no	263	1,4595	0,14	0,97
Cloroformio	↓	no	245	1,446	0,31	0,57
Cloruro di metilene	↓	no	235	1,424	0,32	0,44
Tetraidrofurano	↓	Sì	215	1,407	0,35	0,55
Dietiletere	↓	no	215	1,353	0,29	0,23
Acetone	↓	Sì	330	1,359	0,43	0,32
Acetato di etile	↓	molto poco	260	1,372	0,45	0,45
Diossano	↓	Sì	215	1,422	0,49	1,54
Acetonitrile	↓	Sì	190	1,344	0,5	0,37
2-propanolo	↓	sì	210	1,377	0,63	2,3
Metanolo	↓	sì	205	1,329	0,73	0,6
Acqua	polare	sì	––	1,3328	> 0,73	1

Colonne in silice non legata esposte a solventi polari

I campioni e le fasi mobili contenenti solventi molto polari, come l’acqua o gli alcoli, possono disattivare le colonne HPLC di silice non rivestita. Ciò può ripercuotersi in modo marcato sulle prestazioni della colonna, in particolare in termini di ritenzione e selettività del soluto. (Figura C2). Anche un flussaggio prolungato della colonna con un solvente non polare è in grado di ripristinare solo parzialmente le prestazioni della colonna, con inevitabile spreco di sostanze chimiche. Una soluzione di rigenerazione di silice, rimuovendo il materiale polare intrappolato, permette di ripristinare in modo rapido ed economico le prestazioni della colonna. Pompare la soluzione attraverso la colonna interessata per 10 minuti a una velocità di 4 mL/minuto; flussare poi con la fase mobile per 10 minuti a una velocità di 2 mL/minuto. Valutare le prestazioni della colonna utilizzando la stessa miscela di prova che serve a valutare le colonne di silice (N° Cat. 58281). Le prestazioni dovrebbero tornare ad essere praticamente quelle precedenti all’esposizione al solvente polare (Figura C3).

Soluzione di rigenerazione della colonna in silice, 200 mL (N° Cat. 33175).

Figura C. La soluzione di rigenerazione permette di ripristinare le prestazioni della colonna in silice

Miscele di prova per colonne

Miscele per la valutazione delle prestazioni di colonne per HPLC

Disporre di miscele di prova debitamente formulate permette di risolvere i problemi cromatografici, ottimizzare l’efficienza del sistema e valutare le colonne in condizioni nelle quali il loro funzionamento viene interpretato correttamente. Per evitare che subiscano fotodegradazione, le nostre miscele vengono confezionate e spedite in ampolle color ambra, con accluse istruzioni per un impiego corretto e un’interpretazione dei risultati altrettanto corretta.

È possibile scegliere tra le nostre miscele in base al tipo di colonna o al tipo di applicazione specifica. Per esplorare la nostra ampia selezione di miscele di prova, consultate il nostro catalogo oppure contattate il Servizio Tecnico.

Prevenire e risolvere i problemi di hardware più comuni.

Prevenire le perdite

Nelle analisi HPLC, le perdite sono uno dei problemi più comuni. Per ridurre al minimo le perdite nel vostro sistema cromatografico, evitate di utilizzare apparecchiature e raccordi provenienti da case produttrici diverse tra loro. Se, sulle prime, è possibile forzare raccordi non compatibili in maniera che funzionino, a lungo andare nelle separazioni emergeranno problemi e il dover continuamente intervenire sulle connessioni finirà per determinare perdite a livello dei raccordi. Se la sostituzione con un raccordo non originale è strettamente necessaria, prima di procedere utilizzate opportuni adattatori e verificate che non ci siano perdite a livello delle connessioni.

Sali in concentrazioni elevate (> 0,2 M) e fasi mobili caustiche possono ridurre l’efficienza delle guarnizioni della pompa. La durata in esercizio delle guarnizioni del rotore dell’iniettore dipende anche dalla composizione della fase mobile, in particolare quando si opera a pH elevati. In alcuni casi, un utilizzo prolungato di reagenti di coppia ionica esercita sui pistoni della pompa un effetto lubrificante, che può causare piccole perdite a livello della guarnizione. In presenza di certi solventi, alcune guarnizioni hanno un cattivo funzionamento. Prima di usare una pompa in condizioni critiche, leggere le indicazioni del costruttore dello strumento. Per la sostituzione delle guarnizioni, consultare la sezione “manutenzione” del manuale della pompa.

Disostruire il setto della colonna

Un altro dei problemi ricorrenti nelle analisi HPLC è dato dalla presenza di un setto della colonna ostruito. Per ridurre al minimo sin dall’inizio questo tipo di problema, è consigliabile utilizzare un filtro precolonna e una colonna di guardia.

Per pulire la zona di ingresso della colonna, scollegare innanzitutto la colonna e ricollegarla in senso inverso. Collegare la colonna alla pompa (senza collegarla al rivelatore) e pompare solvente attraverso la colonna ad una velocità doppia rispetto a quella standard. Per rimuovere dal setto di ingresso piccole quantità di materiale particellare dovrebbero essere sufficienti all’incirca 10-15 volumi di colonna. Dopo la pulizia, valutare le prestazioni della colonna utilizzando una miscela di prova standard.

Sostituire il setto all’ingresso della colonna

In alcune circostanze né il flussaggio con solvente (vedi sopra) né le procedure di rigenerazione (Tavola 2) riescono a ripristinare le prestazioni della colonna. Se avete identificato nella colonna la causa del problema e le procedure di ripristino fin qui messe in opera hanno fallito, è possibile che abbiate a che fare con uno spazio vuoto nell’impaccamento o con un intasamento persistente del setto di ingresso.

Come misura estrema, aprire il terminale di ingresso della colonna. Attenzione: l’apertura del terminale di ingresso, e ancor più quella del terminale di uscita, possono danneggiare l’impaccamento della colonna in maniera permanente. Prima di aprire le colonne, si prega di consultare attentamente la letteratura provvista dal produttore (Non aprire mai nessuna delle estremità terminali di una colonnariempita con resina

Per aprire una colonna, seguire la procedura qui riportata.

1. Scollegare la colonna dal sistema. Per evitare che il materiale di impaccamento fuoriesca dalla colonna, mettere in atto con la massima tempestività le operazioni qui descritte.
2. Usando una morsa e una chiave, o due chiavi, rimuovere con cautela il raccordo terminale di ingresso (Figura D). Se il setto rimane nel raccordo, rimuoverlo picchiettando il raccordo su una superficie rigida. Se il setto rimane nella colonna, farlo scivolare fuori piuttosto che sollevarlo. In questo modo, l’integrità del letto di impaccamento verrà preservata.
   Per rimuovere la copertura del setto poroso, le colonne dei sistemi modulari possono aver bisogno di un utensile speciale (p.es., N° Cat. 55216).
3. Esaminare il setto poroso usato. Se il setto è posizionato correttamente, la compressione del setto contro il tubo di acciaio inossidabile lascia un segno ad anello attorno al bordo del setto, dalla parte della colonna. L’assenza dell’anello indica che la ferrula è collocata troppo vicino all’estremità del tubo. La connessione lasca che ne risulta permette la fuoriuscita di silice o funziona da camera di miscelazione.
4. Esaminare il letto di impaccamento. Se risulta schiacciato o frantumato, occorre una nuova colonna.
5. Sostituire il setto poroso.
6. Sostituire il raccordo terminale. Stringere il raccordo a mano, poi serrare di 1/4 di giro con la chiave.

Figura D. Spaccato tipico di una colonna HPLC

Selezione di prodotti per la protezione delle colonne

Apparato per la filtrazione della fase mobile Supelco™
(collegare alla linea di aspirazione)

Proteggete il vostro strumento e le vostre colonne rimuovendo particelle e gas presenti nei solventi e negli altri componenti della fase mobile. I filtri a membrana in Nylon 66 sono compatibili con tutti i solventi di uso comune in HPLC.

Apparato di filtrazione 1
(collegare ad una beuta codata da 1000 mL)
Comprende un imbuto in vetro da 250 mL, una base in vetro con tappo, una pinza a molla, un supporto di filtrazione e uno schermo in acciaio inossidabile, 10 guarnizioni in Teflon, 50 filtri in Nylon 66 (47 mm di diametro, pori da 0,45 μm).

Apparato di filtrazione 2
(collegare alla linea di aspirazione)
Comprende un imbuto in vetro da 250 mL, una base da imbuto conica 34/45, una beuta conica da 1000 mL con campana in vetro 34/45, una pinza a molla, un supporto di filtrazione e uno schermo in acciaio inossidabile, 10 guarnizioni in Teflon, 50 filtri in Nylon 66 (47 mm di diametro, pori da 0,45 μm).

Apparato per la filtrazione della fase mobile Supelco™

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Parti di ricambio in vetro

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Filtri

Per proteggere le colonna per HPLC dal particolato che si può accumulare sul setto della colonna, con conseguente sdoppiamento di picchi e innalzamento della contropressione, è fondamentale ricorrere a un filtro precolonna. Le particelle che si accumulano possono provenire dalla fase mobile (specialmente nel caso in cui i tamponi vengano miscelati con solventi organici), dalle guarnizioni della pompa e dell’iniettore e dai campioni. Per proteggere colonne contenenti particelle da 5 μm più utilizzare un setto poroso da 2,0 μm, per particelle inferiori ai 5 μm ricorrere ad un setto per colonne da 0,5 μm.

Filtri Supelco

Connessione diretta (direct-connect): protegge le colonne analitiche e le colonne di guardia. 
I nostri filtri precolonna possono essere collegati direttamente, serrandoli a mano, a qualsiasi colonna o colonna di guardia HPLC tra quelle presenti nel nostro catalogo attuale, o a qualsiasi colonna che disponga di raccordi terminali compatibili con il sistema Valco. Tappo e corpo in PEEK, setto poroso in acciaio inossidabile. Se siete interessati a un sistema privo di metalli, potete ricorrere ai setti di ricambio in PEEK/Teflon (N° Cat. 57430-U).

Filtri Supelco®

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Filtri a schermo e setti porosi precolonna Valco3

Installazione in linea. L’impiego di filtri con volume morto ridotto e di comprovata efficacia protegge la vostra colonna dalle particelle, senza per questo limitarne le prestazioni. Il setto poroso sostituibile da 1/8” con pori da 0,5 μm protegge colonne con impaccamenti da 3 μm o da 5 μm; lo schermo sostituibile ha invece pori da 2 μm. Quando occorre una maggior capacità di filtrazione (per la maggior parte delle applicazioni), optate per il filtro con setto poroso; scegliete invece il filtro a schermo quando è necessario operare con un volume morto minimo (p.es., con le colonne di tipo microbore). Utilizzare con tubi con D.E. 1/16”; i raccordi da 1/16” sono inclusi.

Filtri e setti precolonna Valco

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Filtri precolonna Isolation Technologies

Installazione in linea. Questo filtro d’ingresso ad alta capacità riduce al minimo il volume morto e l’allargamento di banda per evitare la perdita di efficienza della colonna e, al tempo stesso, proteggerla. Porosità del setto: 0,5 μm. Fornito completo, come mostrato in figura.

Filtri precolonna per alte pressioni SSI

Installazione in linea. Il disco filtrante in acciaio inossidabile 316 (pori da 0,5 μm) può essere sostituito facilmente, senza dover rimuovere il raccordo terminale della colonna. Pressione massima di esercizio: 15.000 psi (1054 kg/cm²). Per tubi da 1/16".

Filtri precolonna per alte pressioni SSI

Posizionare tra la pompa e l’iniettore per operare una filtrazione finale della fase mobile. Elemento in acciaio inossidabile 315 (pori da 0,5 μm) facile da sostituire. Pressione massima di esercizio: 15.000 psi (105MPa). Per tubi con D.E. 1/16”, filettatura 10-32.

Filtri precolonna Isolation Technologies

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Filtri precolonna Upchurch

Installazione in linea. Corpo in acciaio inossidabile con raccordi terminali in polietere etere chetone (PEEK) inerte e un setto in PEEK da 0,5 μm o 2 μm
in uno dei due raccordi terminali.

Filtri precolonna Upchurch

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 Iniettori Rheodyne 7725 e 7725i

L'iniettore modello 7725 di Rheodyne permette l’iniezione di campioni da 1 μL-5 mL in modo preciso ed accurato. La sua struttura robusta e di facile manutenzione dispone di numerose funzionalità avanzate:

• Sistema a flusso continuo (vedi figura) brevettato – nel passare dalla posizione di carico (LOAD) alla posizione di iniezione (INJECT) il flusso non si interrompe.
  
• Guarnizione facilmente regolabile mediante vite di pressione sulla zona frontale dell’iniettore.
  
• Marcata inclinazione delle porte (angolo di 30°) per un accesso ai raccordi facilitato

L’iniettore è corredato da un loop del campione da 20 μL e viene fornito con una guarnizione del rotore in Vespel che può essere sostituita con una guarnizione del rotore in Tefzel per impieghi in un intervallo di pH più ampio (da 0 a 14). Impostato a 5000 psi (345 bar), regolabile fino a 7000 psi (483 bar). Il modello 7725i è dotato di un interruttore di posizione di tipo reed incorporato.

L’iniettore modello 7725 riduce il deterioramento dovuto all’uso delle vostre colonne

Durante l’iniezione del campione, una valvola di iniezione HPLC convenzionale interrompe momentaneamente il flusso, sottoponendo la colonna a sbalzi di pressione ripetuti. Il sistema brevettato MBB (make-before-break) della Rheodyne instaura il nuovo collegamento prima che si interrompa il vecchio, in modo che il flusso non subisca interruzioni.

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Parti di ricambio per pompa Optimize Technologies

Per evitare costosi tempi di fermo, può essere utile ricorrere ad un programma di manutenzione preventiva che contempli la sostituzione regolare di quelle parti della pompa che sono soggette a usura. Disponiamo di un’ampia gamma di valvole di non ritorno, guarnizioni e pistoni della Optimize Technologies, le cui prestazioni rispondono o addirittura vanno oltre alle specifiche dei costruttori di pompe. Per consultare una selezione aggiornata di parti di ricambio per pompa, consultate il catalogo Supelco corrente o contattate il nostro Servizio Tecnico.

Attenuatore di pulsazioni SSI LO-Pulse

Un attenuatore di pulsazioni regola le pulsazioni della pompa così che la linea di base sia più stabile. L’attenuatore di pulsazioni SSI LO-Pulse è un dispositivo brevettato compatibile con pompe per HPLC a pistone singolo di tipo reciprocante (pompa Altex 110A, pompe Eldex, mini-pompa LDC VS, modelli SSI 200 e 300 ecc.). Migliora la precisione delle analisi quantitative e i limiti di rivelabilità dei componenti in tracce presenti nel campione in un intervallo di pressione tra 500 psi e 6000 psi (35-420 kg/cm²). Raccordi e istruzioni sono acclusi.

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