Protokol sady pro rychlou ligaci DNA

Úvod do sady pro rychlou ligaci DNA

Sada pro rychlou ligaci DNA obsahuje všechna činidla potřebná k ligaci. Souprava umožňuje ligování DNA s tupými nebo lepivými konci při teplotě 15-25 °C. V závislosti na koncentraci DNA v reakci budou produkty ligace buď cirkulární (pokud je koncentrace DNA nízká), nebo konkatérní (pokud je koncentrace DNA vysoká). Ligovaná DNA je vhodná k přímému použití v transformačních experimentech.

Protokol sady pro ligaci DNA

Chcete-li provést úspěšný klonovací experiment, použijte tyto manipulační kroky jako návod pro použití sady pro rychlou ligaci DNA (11635379001).

Poznámka: Klonovací experimenty zahrnují širokou škálu produktů. Enzym ligáza v sadě Rapid DNA Ligation Kit je pouze jedním z nich. Pro úspěch je třeba optimalizovat celý pracovní postup klonování a použít vhodné kontroly pro každý krok.

Příprava DNA k ligaci

• Čistota vektoru/vložené DNA: Používejte vysoce přečištěnou DNA: Doporučujeme použít sadu pro čištění vysoce čistých PCR produktů nebo gradientové čištění chloridem cesia. Miniprep DNA může obsahovat nečistoty, které snižují účinnost ligace.

• Příprava vektoru/Insertu: Restrikční enzymy by neměly obsahovat kontaminaci nukleázami. Mělo by se rovněž zabránit aktivitě hvězdic. Pokud se provádí dvojí digesce s enzymy náchylnými k hvězdicové aktivitě, nahlédněte do plakátu Restrikční enzymy Roche (nebo do katalogu Roche Applied Science), abyste vybrali optimální pufr pro danou kombinaci enzymů. Kdykoli je to možné, použijte pro dvojité digesce pufr H.

• Defosforylace: Defosforylujte DNA vektoru (s výjimkou recirkulace), abyste zabránili samocirkulaci. Postupujte přesně podle pokynů pro použití alkalické fosfatázy, zejména pro krok inaktivace. Alkalická fosfatáza musí být inaktivována v přítomnosti EGTA a zahříváním po dobu 10 minut na +65 °C, po kterém následuje ošetření fenolem a srážení EtOH. Jiné postupy včetně odstřeďovacích kolonek nejsou účinné. Alkalická fosfatáza je extrémně stabilní enzym a úprava popsaná v příbalovém letáku slouží k úplné inaktivaci.

• Pufry pro uchovávání DNA: Souprava pro rychlou ligaci DNA je dodávána s pufrem pro ředění DNA. Tento pufr použijte k úpravě koncentrace DNA pro ligaci. DNA vždy resuspendujte v pufrech, které neobsahují více než 0,1 mM EDTA. Vyšší koncentrace EDTA inhibují aktivitu ligázy, protože EDTA komplexuje Mg²⁺ ionty, které ligáza potřebuje jako kofaktor. Nejvhodnější je použití Tris-pufru s 10 až 50 mM Tris; pH 7,5 až 8.

 

Ligace

• Pufr na DNA: Pro rozpuštění DNA, která má být ligována, použijte pufr na ředění DNA dodaný s touto sadou. Případně rozpusťte DNA buď v pufru s velmi nízkou koncentrací EDTA do 0,1 mM, nebo ještě lépe bez EDTA.

• Množství DNA: Maximální množství DNA, které má být ligováno za 5 min, by nemělo překročit 200 ng.

• Objem reakce: Pro rychlou ligaci DNA je objem reakce omezen na celkem 20 μl. U větších objemů je třeba prodloužit reakční dobu až na 30 minut! Objem všech ostatních činidel v reakci je třeba odpovídajícím způsobem zvýšit.

Poznámka: U plazmidových vektorů nepřekračujte 200 ng DNA ve 20 ml objemu reakce. V opačném případě vzniknou vysoce konkávní ligační produkty a dojde k potlačení cirkulace.

• Ligační pufry: Při práci se sadou Rapid DNA Ligation Kit je nutné bezprostředně před použitím důkladně promíchat obsah lahviček 1 a 2. V případě, že se jedná o pufry, je nutné je použít k přípravě pufrů.

• Inaktivace T4 DNA ligázy: V zásadě lze T4 DNA ligázu inaktivovat 10minutovou inkubací při teplotě +65 °C. V případě, že je T4 DNA ligáza inaktivována, je nutné ji inaktivovat. Tento krok tepelné inaktivace proveďte pouze v případě, že se ligační směs používá k jiným experimentům než k transformaci. Tepelná inaktivace ligačních směsí před transformací/balením vede k drastickému snížení výtěžku transformantů/plaků (20krát).

• Skladování ligačních směsí: Při pozdější transformaci skladujte ligační směsi při teplotě -15 až -25 °C.

• Molární poměry vektorů: Insertu (plazmidové vektory): U soupravy pro rychlou ligaci DNA se doporučuje používat molární poměry vektoru k inzertu 1+1, 1+2, 1+3 nebo dokonce 1+5, pokud má být dosaženo ligace s lepivým koncem. Při ligaci tupým koncem účinnost klesá, pokud se použijí vyšší poměry než 1+3.

Následující tabulka uvádí typický výsledek.

Těchto hodnot bylo dosaženo pomocí kompetentních E. coli buněk JM83 připravených podle Hanahanovy metody. K transformaci byla použita pouze 1/10 ligační směsi.

• Množství DNA při transformaci

Hanahanovy buňky jsou citlivé na nadměrné množství DNA, i.Tj. pokud byla transformována celá ligační směs, počet transformantů se snížil:

Buňky ošetřené chloridem vápenatým mají vyšší toleranci k nadbytečnému množství DNA.

• Klonování do λ-vektorů: Pro klonování do λ-vektorů byl zjištěn optimální molární poměr 8 + 1. Při klonování do λ-vektorů se používá molární poměr 8 + 1.

Poznámka: Pro klonování do λ-vektorů by mělo být použito vysoké množství DNA, aby se upřednostnila tvorba konkaterů.

Transformace

Existuje několik různých metod přípravy kompetentních E. coli buněk. Protokoly se liší stupněm obtížnosti a použitými činidly a dosaženou účinností transformace. Níže jsou stručně popsány dvě nejběžnější metody.

• Metoda chloridu vápenatého: Tato metoda byla první publikovanou metodou pro přípravu E. coli buněk kompetentních pro příjem cizí DNA. Je to také nejjednodušší metoda, protože používá pouze chlorid vápenatý v pufru.

Buňky E. coli se vypěstují do rané až střední log fáze a poté se inkubují na ledu v chlorid vápenatém pufru. Maximální účinnost je 1 x 10⁶ až 1 x 10⁷ transformantů/na mikrogram DNA. Pro dosažení maximální účinnosti při jakémkoli transformačním experimentu použijte následující pokyny:

- Buňky vždy uchovávejte na ledu.

- Používejte chlazené (-20 °C) pipety (skleněné nebo plastové), špičky a odstředivky.

- Po kontaktu bakterií s transformačním pufrem je vždy uchovávejte na ledu, a to i během přepravy do centrifugy.

- Buď použijte kompetentní buňky přímo, nebo je skladujte při teplotě -70 °C v přítomnosti 30-50 % glycerolu. Buňky snášejí asi půldenní skladování na ledu bez poklesu účinnosti.

- Všimněte si, že aktivita kmenů Rec A minus během skladování klesá.

- Používejte extrémně čisté skleněné a plastové nádobí.

 

• Hanahanova metoda

Hanahanova metoda používá složitější pufr a je důležité mít činidla velmi vysoké čistoty. Kritické je zejména množství DMSO. Základní manipulace je stejná jako u metody s chloridem vápenatým. Dosahovaná účinnost transformace se pohybuje v rozmezí 1 x 10⁷ až 1 x 10⁹ na mikrogram DNA. Jak již bylo uvedeno, rozhodující je čistota činidel. K transformaci by měla být použita pouze 1/10 objemu ligačního roztoku. Tyto buňky jsou velmi citlivé na nadbytečné množství DNA.

Kontroly 

Je nesmírně důležité provést vhodné kontroly takto:

• Transformace nesestříhané vektorové DNA (např, 50 pikogramů). Výsledek ukazuje účinnost transformace buněk na mikrogram DNA.
• Transformace linearizované neligované vektorové DNA Úplnost štěpení restrikčním enzymem.
• Transformace religionizovaného defosforylovaného vektoru. Výsledek ukazuje účinnost defosforylace.
• Transformace linearizovaného a recirkulovaného vektoru. Výsledek ukazuje účinnost ligování.
• Transformace bez DNA např. pouze s DNA pufrem. Výsledek ukazuje kontrolu kompetentních buněk, tj. žádný růst znamená, že buňky nejsou kontaminovány nebo již obsahují plazmid. Růst na příslušném selektivním médiu znamená, že buňky jsou kontaminované a již obsahují plazmid.

Pokyny pro klonování a transformaci M13

Kmeny, které se používají při klonování M 13, mají speciální genetickou konstrukci plazmidu F', aby bylo zajištěno, že se exprimují F-pili, které jsou receptory pro M 13. V případě, že buňky jsou kontaminované, je třeba je naklonovat. Příslušné kmeny by měly být před inokulací pro transformaci pěstovány na minimálním médiu nebo v závislosti na konstrukci kmene na médiu obsahujícím antibiotika, aby bylo zajištěno, že kmeny stále obsahují F' plasmid. Pro transformaci je důležité, aby kmeny byly v rané až střední logaritmické fázi. Pokud je příslušný kmen v pozdní logaritmické fázi nebo ve stacionární fázi, mohly by být F-pili do určité míry ztraceny, takže na povrchu buněk by nebyl přítomen žádný receptor a získané plaky by mohly být velmi malé.

Důležité informace pro rychlou ligaci DNA do plazmidových vektorů

U soupravy pro rychlou ligaci DNA garantujeme > 1 x 10⁶ transformantů na μg náboženského vektoru pUC18 (lepivý i tupý konec), tj, to znamená, že pouze 2,96 pg vektoru (1 molekula pUC 18 = 2,96 ag [atogramu!]) musí být náboženo, aby byl výsledkem tento výtěžek v transformantech. Této rychlosti religace lze snadno dosáhnout během 5 minut pomocí sady Rapid DNA Ligation Kit.

Poznámka: To také znamená, že při kontrole produktů ligace pomocí agarózového gelu se značná část použité vektorové DNA bude stále jevit jako "neligovaná". Vzhledem k výše zmíněné molekulové hmotnosti pUC 18 je to snadno viditelné.

Rychlost a kinetika ligace konkatérů při klonování s λ-vektory se zcela liší od ligace plazmidů. Pro ligaci konkatemerů musí ligáza spojovat lineární fragmenty v přítomnosti velkého množství DNA. Při klonování s plazmidem musí být insert nejprve ligován na jeden konec linearizovaného plazmid-vektoru a poté musí být druhý konec téhož plazmid-DNA připojen k insertu.