Analyse des protéines par spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse des protéines est largement utilisée pour analyser des échantillons biologiques dans la recherche de candidats biomarqueurs, la recherche en protéomique ainsi que les applications cliniques. Comparée aux autres techniques employées pour la caractérisation à grande échelle des protéines, la spectrométrie de masse est devenue le principal outil de la protéomique en raison de sa facilité d'utilisation dans les analyses complexes.
La spectrométrie de masse est utilisée pour identifier et caractériser quantitativement les protéines d'après leur structure, leurs modifications post-traductionnelles et leurs interactions.
- L'identification des protéines implique généralement une digestion chimique ou enzymatique des protéines en peptides, lesquels sont ensuite analysés par spectrométrie de masse et identifiés par des méthodes de calcul ou par séquençage.
- Les modifications post-traductionnelles peuvent être identifiées par la variation de la masse des résidus d'acides aminés. Les sites de modification peuvent être cartographiés par séquençage ou par des méthodes de calcul.
- Pour l'analyse et le profilage des glycanes, des techniques chimiques ou enzymatiques sont utilisées pour libérer les fractions glycane des glycoprotéines, suivies de la dérivation des glycanes libérés en vue de leur analyse par spectrométrie de masse.
- Les interactions entre protéines sont déterminées par copurification par affinité d'une protéine cible donnée avec toute protéine interagissant avec elle. Elles peuvent également être étudiées plus globalement par chromatographie d'exclusion stérique ou d'échange d'ions avant d'être analysées par spectrométrie de masse.
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Protocoles apparentés
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- solution, 2 μg/mL in acetonitrile, analytical standard
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Pour l'analyse protéomique quantitative, les protéines ou les peptides peuvent être marqués soit chimiquement avec des isotopes stables par marquage TMT ("Tandem Mass Tagging") ou iTRAQ, soit métaboliquement par l'incorporation d'acides aminés marqués (méthode SILAC pour "Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Culture"). La comparaison de l'incorporation des isotopes lourds et légers permet une quantification relative par corrélation entre l'intensité des pics de spectrométrie de masse et l'abondance des protéines. Pour une quantification absolue, les échantillons peuvent être additionnés de peptides synthétiques marqués isotopiquement ou de protéines étalons pour une analyse en mode SRM ("Selected Reaction Monitoring").
En spectrométrie de masse des protéines, la masse des différents peptides et protéines est déterminée par la mesure du rapport masse/charge (m/z) de leurs ions en phase gazeuse. Les spectromètres de masse convertissent d'abord les molécules protéiques en ions en phase gazeuse à l'aide d'une source d'ions. Ensuite, un analyseur de masse sépare les analytes ionisés en fonction de leur rapport m/z. Un détecteur enregistre alors le nombre d'ions pour chaque valeur de rapport m/z. La désorption/ionisation laser assistées par matrice (MALDI pour "Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization") et l'électronébulisation (ESI pour "Electrospray Ionization") sont deux techniques couramment utilisées pour ioniser les peptides ou les protéines.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF
La désorption/ionisation laser assistées par matrice (MALDI) est une technique d'ionisation qui utilise une matrice absorbant l'énergie d'un laser pour produire des ions avec une fragmentation minimale des molécules protéiques. L'échantillon est d'abord mélangé avec une matrice appropriée. Ensuite, un laser pulsé irradie l'échantillon, déclenchant l'ablation et la désorption de l'échantillon et de la matrice. Les molécules à analyser sont alors ionisées par protonation ou déprotonation dans les gaz obtenus par ablation, avant d'être analysées par spectrométrie de masse.
Spectrométrie de masse par électronébulisation
L'électronébulisation (ESI pour "Electrospray Ionization") produit des ions au moyen d'un électronébuliseur dans lequel une haute tension est appliquée à l'échantillon liquide pour créer un aérosol, ce qui produit des ions avec une fragmentation minimale des peptides et des protéines. L'électronébulisation est couramment utilisée en spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide (LC-MS), car l'éluat de la chromatographie liquide peut être directement introduit dans un électronébuliseur pour une analyse en tandem.
Procédure
Digestion et marquage
Des protéases possédant une spécificité de site, comme la trypsine, sont utilisées pour cliver les protéines en petits fragments afin de permettre leur identification par correspondance entre les spectres expérimentaux et les spectres théoriques contenus dans des bases de données de protéines, ou par comparaison avec des étalons d'analyse. Pour la quantification relative, les cultures cellulaires peuvent être marquées métaboliquement avec des isotopes stables par l'incorporation d'acides aminés marqués, ou les échantillons peuvent être marqués chimiquement avec des isotopes stables. Le dopage des échantillons avec des peptides synthétiques marqués par des isotopes permet une quantification absolue par une analyse en mode SRM.
Étalonnage et standardisation en spectroscopie de masse des protéines
Des étalons peuvent servir de témoin pour l'analyse des échantillons. Ils peuvent également servir à déterminer l'identité des protéines, la sensibilité expérimentale, l'efficacité de la digestion et faciliter la séparation chromatographique et l'analyse quantitative.
Séparation chromatographique
La chromatographie permet de séparer les protéines et les peptides en échantillons plus faciles à gérer pour l'analyse. Étant donné que plusieurs peptides différents peuvent avoir une masse similaire, la chromatographie liquide haute performance (HPLC pour "High-Performance Liquid Chromatography") est souvent utilisée pour empêcher l'ajout simultané de peptides ayant une masse très proche ou identique dans le spectromètre de masse, ce qui accroît la plage ou dynamique de mesure globale.
Détection et analyse
Les protéines et les peptides sont ionisés par MALDI ou ESI avant d'être détectés et analysés. Un analyseur de masse distingue les ions d'après leur rapport m/z. Les profils de fragmentation résultants peuvent être utilisés pour l'identification, et les échantillons peuvent être quantifiés soit de manière relative par l'évaluation du rapport d'intensité des pics des échantillons différenciés par marquage isotopique, soit de manière absolue par une analyse en mode SRM avec des étalons internes marqués.
À la Une
Amorce pour marquage de type SILAC ("Stable Isotope Labelling With Amino Acids in Culture")
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Procédure et outils d'analyse des protéines par spectrométrie de masse
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