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Marcatura e rilevamento degli acidi nucleici

Metodi e protocolli di marcatura e rilevamento del DNA e dell'RNA

La gamma di metodi di marcatura e rilevamento degli acidi nucleici, dei prodotti della PCR e degli oligonucleotidi è molto ampia. I reagenti e i metodi comunemente utilizzati per la marcatura e il rilevamento degli acidi nucleici dipendono da diversi fattori, tra cui il tipo di molecola da marcare e l’applicazione a valle. Di conseguenza, per marcare gli acidi nucleici e incorporarvi molecole diverse, quali fluorofori, enzimi ed elementi radioattivi, vengono impiegati sia metodi enzimatici che chimici.

Marcatura degli acidi nucleici e sonde

Gli acidi nucleici possono essere marcati lungo tutta la molecola o alle estremità 5’ e 3’. Le sonde di acidi nucleici sono particolarmente utili per i test di ibridazione, come il rilevamento dell’RNA nel Northern blot o del DNA nel Southern blot. Per distribuire il marcatore lungo tutta la sonda si utilizzano vari metodi di marcatura, tra cui la PCR con desossinucleotidi marcati (dNTP) o nucleotidi trifosfati (NTP), il priming casuale e la traduzione di nick. La marcatura terminale è particolarmente utile per i test che studiano le interazioni tra acidi nucleici e proteine, al fine di evitare ostacoli sterici.

Marcatura degli acidi nucleici e test di rilevamento

A seconda del metodo di marcatura, per le sonde marcate con enzimi si ricorre spesso al rilevamento colorimetrico, mentre il rilevamento autoradiografico è indicato per le sonde radioattive. Tra le sonde più comuni figurano quelle marcate con digossigenina (DIG) e con fluoresceina, che possono essere utilizzate in combinazione per facilitare il rilevamento multicolore delle sonde quando accoppiate a reazioni colorimetriche (ad es. fosfatasi alcalina). Analogamente, l’incorporazione di Biotina-16-dUTP tramite PCR è possibile anche con la maggior parte delle DNA polimerasi come metodo aggiuntivo di marcatura e rilevamento. L’ibridazione in situ fluorescente (FISH) utilizza sonde fluorescenti per rilevare sequenze di DNA e il successo del rilevamento e delle analisi a valle è in parte determinato dalla sensibilità e dalla risoluzione del microscopio a fluorescenza a disposizione del ricercatore.

Applicazioni del DNA e dell’RNA marcati

Il trasferimento di macromolecole su membrane in fase solida è noto come blotting. Grazie alla specificità delle sonde marcate, l’ibridazione tra l’acido nucleico e la sonda offre ai ricercatori la possibilità di rilevare sia sequenze di DNA che di RNA in miscele complesse di acidi nucleici. Inoltre, questi metodi consentono di raccogliere ulteriori informazioni preziose, tra cui l’analisi dell’espressione genica, della dimensione dell’mRNA e del numero di copie, a seconda del test. L’ibridazione in situ è inoltre comunemente utilizzata dai ricercatori per rilevare una o più sonde marcate in modo diverso (ad esempio, sonde marcate con DIG e con fluoresceina).

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