Sequenziamento

Sequenziamento con metodo Sanger

Inizialmente la composizione degli acidi nucleici veniva determinata usando metodi di chimica analitica. Fred Sanger e colleghi cominciarono a mettere a punto delle metodiche, inizialmente basate su frammenti digeriti radiomarcati e frazionamento bidimensionale, che consentirono di determinare alcune delle prime sequenze di acidi nucleici complete. I progressi nel settore sono proseguiti per diversi decenni, alimentando la creazione di una libreria sempre più vasta di proteine e genomi sequenziati. Tra essi, la separazione dei nucleotidi in base alla lunghezza grazie all'elettroforesi su gel seguita da elettroforesi capillare. Infine, con l'avvento dei nucleotidi marcati con tag fluorescenti e dell'analisi computerizzata di ogni frammento di acido nucleico, è nato l’attuale metodo di sequenziamento di Sanger.

Metodologia per il sequenziamento del DNA

Sebbene nel tempo i metodi di sequenziamento del DNA siano stati continuamente migliorati, alcuni componenti fondamentali sono tuttora necessari ed utilizzati anche nelle piattaforme di sequenziamento moderne. Solitamente la preparazione del DNA prevede l'isolamento e la purificazione del DNA dall’organismo ospite. Ulteriori elementi critici, tra cui le basi di DNA, i primer, le basi modificate con tag fluorescenti (nucleotidi terminatori) e la DNA polimerasi, vengono uniti in un unica provetta. nella quale, grazie a una serie di fasi di riscaldamento e raffreddamento, si originerà una libreria di sequenze di DNA più brevi della sequenza completa del DNA stampo; ogni frammento rappresenta una porzione della sequenza completa e termina con un nucleotide marcato con fluorescenza. I nuovi frammenti di DNA contenenti i nucleotidi con marcatura fluorescente vengono quindi separati in base alla lunghezza, fatti passare attraverso un capillare e ordinati in base alle dimensioni. Si utilizza quindi un laser per eccitare la base fluorescente presente in ciascun filamento ed il segnale viene acquisito da un rilevatore. Infine, un’analisi computerizzata elabora le informazioni raccolte e ricostruisce la sequenza di DNA completa.