Metodi di analisi dei pirogeni
I test sui pirogeni determinano la quantità di pirogeni nei prodotti farmaceutici o biofarmaceutici parenterali e sono regolati da diversi standard di organizzazioni come la Food and Drug Administration (FDA), la Farmacopea degli Stati Uniti (USP) o la Farmacopea Europea (EP). La sterilità di un prodotto non implica che sia privo di pirogeni. Pertanto, anche i farmaci dichiarati sterili devono essere testati per la presenza di pirogeni, al fine di prevenire reazioni febbrili nei pazienti.
La contaminazione da pirogeni può verificarsi durante la produzione o la somministrazione di prodotti farmaceutici, bioterapeutici e dispositivi medici, ma la presenza di pirogeni può anche essere una caratteristica intrinseca del prodotto, come ad esempio gli adiuvanti nei vaccini o i lipopeptidi sintetici.
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Assicurare la sicurezza: Test sui pirogeni dei prodotti farmaceutici con il Monocyte Activation Test (MAT) per rilevare endotossine e pirogeni non endotossinici.
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Che cos'è un pirogeno?
Un pirogeno è una sostanza che provoca un aumento della temperatura (reazione febbrile) in un essere umano o in un animale attraverso l'attivazione del sistema immunitario innato. Costituiscono un gruppo eterogeneo di contaminanti che comprende sostanze microbiche e non microbiche. I pirogeni possono essere classificati in due gruppi: endotossine e pirogeni non endotossinici (NEP).
Le endotossine sono sostanze presenti nei batteri Gram-negativi. I pirogeni non endotossinici sono altre sostanze microbiche, comprese quelle derivate da batteri Gram-positivi o virus e i pirogeni provenienti da lieviti e funghi. Le sostanze pirogene non microbiche possono anche provenire da particelle di gomma, particelle microscopiche di plastica o composti metallici negli elastomeri.
Sono disponibili diversi metodi di analisi per la rilevazione dei pirogeni. Possono essere classificati in base al tipo di contaminante che rilevano e alla necessità di materiali animali per eseguire il test, come descritto nella tabella seguente:
| Rilevazione di una vasta gamma di pirogeni | Rilevamento delle sole endotossine | |||
|---|---|---|---|---|
| Metodo basato sull'animale | Test dei pirogeni del coniglio (RPT) | Test delle endotossine batteriche (BET) | ||
| Metodo in vitro | Test di attivazione dei monociti (MAT) | Fattore C ricombinante (rFC) |
Test di pirogeno del coniglio
Il test di pirogeno del coniglio (RPT) consiste nel misurare l'aumento di temperatura dei conigli dopo l'iniezione endovenosa del prodotto testato. Il RPT fornisce risultati qualitativi e la sensibilità è piuttosto bassa. Anche la robustezza del test è limitata, a causa dello sviluppo della tolleranza ai pirogeni nei conigli dopo iniezioni ripetute, o dello stress dei conigli durante l'esecuzione del test.
Nota: il Rabbit Pyrogen Testing (RPT) è ora vietato in Europa e il Monocyte Activation Test (MAT) è il metodo di scelta per rilevare i pirogeni endotossinici e non endotossinici.
Monocyte Activation Test
Il Test di attivazione dei monociti (MAT) è un'alternativa ai metodi basati sugli animali per la rilevazione di pirogeni endotossici e non endotossici. Il test di attivazione dei monociti imita la reazione immunitaria umana incubando i monociti con il campione analizzato. In presenza di pirogeni, i monociti si attivano e producono molecole infiammatorie, le citochine, responsabili della reazione febbrile. Le citochine vengono quindi rilevate con un test immunologico (ELISA) che prevede l'uso di anticorpi specifici e una reazione enzimatica a colori.
Nota: a partire dal luglio 2025, la Commissione della Farmacopea Europea (Ph. Eur.) raccomanda l'uso del test di attivazione dei monociti (MAT) come metodo preferenziale per il test dei pirogeni. Il Rabbit Pyrogen Test (RPT) è ora vietato in Europa.
Leggi l'articolo e discutere ulteriormente con i nostri esperti per passare al MAT che rileva pirogeni endotossinici e non endotossinici e per seguire la tendenza normativa.
Test di endotossina batterica (test LAL)
Il metodo più comune per il test delle endotossine è il test del lisato di amebociti di Limulus (LAL test); un test basato sul lisato di amebociti del sangue di granchio di cavallo. Il lisato delle cellule ematiche del granchio di cavallo reagisce naturalmente con le endotossine batteriche in una reazione di coagulazione. Questo metodo ha un'elevata sensibilità per la quantificazione delle endotossine, ma non rileva i pirogeni non endotossinici.
Fattore C ricombinante (rFC)
Il Fattore C ricombinante è una proteina geneticamente modificata che si trova normalmente nel lisato amebocitario di Limulus. In questo test, il Fattore C reagisce con l'endotossina e si accoppia con un marcatore per produrre un prodotto finale quantificabile e fluorescente. Il test del Fattore C ricombinante utilizza lo stesso principio del test LAL, ma senza la necessità di materiale di derivazione animale.
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