標準的な逆転写プロトコル

逆転写

逆転写（RT）は、逆転写酵素とdNTPを使用してRNAをcDNAに変換するプロセスです。

RTステップをTotal RNAに対して実施することにより、サンプル中の代表的なすべてのRNA転写産物から包括的なcDNAを生成するか（通常、2ステッププロトコルによる）、RTステップを遺伝子特異的なアプローチで実施することにより、目的のRNAのみをcDNAに変換することが可能です（通常、1ステッププロトコルに従う）。

以下の実験プロトコルは、実験条件に合わせて修正することが可能な、基本的なRTプロトコルとして利用できます。一般的には、cDNAを希釈してからPCR/qPCRに添加する2ステッププロセスを用いてcDNAを調製するか、両プロセスが順次実行される1ステップ反応液を調製します。

装置

• 標準的なPCR装置または加熱ブロック
• RTセットアップのための層流フード（オプション）

試薬

• RNA（約1 µg/µLの保存溶液）。
• ReadyScript^™ 2ステップcDNA合成キット（シグマRDRT）。別の逆転写キットを、オリゴdTプライマーまたはランダムプライマー、あるいはその両方と組み合わせて使用することもできます。
• PCRグレード純水：PCRグレード純水（W1754 または W4502）を20 mLのアリコートに小分けして凍結します。各反応には新しいアリコートを使用します。

消耗品

• 滅菌済みフィルターピペットチップ
• 滅菌済み1.5 mLねじ蓋式微量遠心チューブ（CLS430909）
• PCRチューブおよびプレートは、目的とする形式に合ったものを選択してください。
  • 個別の薄肉200 µL PCRチューブ（シグマZ374873 または P3114）
  • プレート
      -  96ウェルプレート（シグマZ374903）
      -  384ウェルプレート（シグマZ374911）
  • プレートシールまたはキャップ
      -  ThermalSeal RTS^™シーリングフィルム（シグマZ734438）
      -  ThermalSeal RT2RR^™フィルム（シグマZ722553）

方法

調製

1. ReadyScript^™ キットの構成要素およびRNAサンプルを氷上に置きます。
2. 混合し、軽く遠心して内容物をチューブの底に集めます。

反応

1. コントロールを含む必要な反応数を決定します。すべての反応に必要な各構成成分の容量を計算して合わせます（ピペッティングエラーを想定して10%増やします）。 表P10-26 に従い、0.2 mLチューブまたは氷上に置かれた96ウェルプレートを使用してください。PCRプレートを使用する場合は、プレート概略図に従い、試薬が正しいウェルに添加されるようにします。

表P10-26.ReadyScript^™ cDNA合成反応マスターミックス

試薬	単一の反応液20 µL あたりの容量（µL）
ReadyScript™ cDNA合成ミックス（5× RTブレンド）	4
Total RNAテンプレート—可変（1 µg～10 pg）	1
PCRグレード水	15

2. 各反応液を密閉した後、軽くボルテックスして内容物を混合します。軽く遠心して構成成分を反応チューブの底に集めます。
3. 表P10-27に従い、反応ミックスをインキュベートします。

表P10-27.ReadyScript^™ cDNA合成反応温度のインキュベーションプロファイル

温度（℃）	時間（分）
25	5
42	30
85	5
4	保持

4. cDNA合成の終了後、5～10倍に希釈した第一鎖反応液（2～4 µL）をPCR増幅に使用します。  
   注記：ReadyScript^™試薬を使用する場合は、希釈していないcDNA 2～4 µLを、阻害を引き起こすことなくPCRに添加することができます。必要に応じて、cDNA産物を10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 mM EDTAで希釈し、－20℃で保存することができます。

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