Sanger Whole Genome CRISPR Libraries
（サンガー 全ゲノム クリスパー・ライブラリー）

Loss-of-function（機能喪失）を使った 全ゲノムスクリーニングは、生物学的プロセスの基礎となる遺伝子および経路を発見するための強力なアプローチです。 関心のある遺伝子およびパスウェイの解明を支援するために、私たちはWellcome Sanger Institute（ウェルカム・サンガー研究所）と協力して、ヒトおよびマウスゲノム用の最初のアレイ型CRISPRノックアウトライブラリーを作成しました。¹  Sangerライブラリーでは、17,000を超えるヒト遺伝子と20,000を超えるマウス遺伝子に対して、最適化された2つのガイドRNA（gRNA）がラインナップされており、次のエキサイティングな発見に役立つ強力なツールです。

アレイ型スクリーニングではトランスフェクションが困難な細胞においても効果的かつ汎用性があります

プール型のライブラリーでも全ゲノムノックアウトは可能ですが、アレイ型のアプローチには多くの利点があります。

• 表現型の豊富な評価内容：細胞死や増殖能にとどまらない細胞イメージング、蛍光、発光、比色測定を用いた機能的アッセイと解析の可能性における柔軟性
• スムーズなデータ解析：デコンボリューションを必要としない簡便なヒット遺伝子の同定
• 高感度：すべてのウェルに1つの標的を設定することで、より優れたシグナル対ノイズ比が得られる
• 候補遺伝子同定の簡便さ：遺伝子型と表現型の相関がより高い
• 柔軟性：初代細胞やニューロンを含むより幅広い細胞に適用できる

Sangerライブラリーは、Sigma-Aldrich^®のポートフォリオ専用の一般試薬として入手できます。Sangerライブラリーを他のツールと組み合わせて、必要な結果を得ることができます。例えば、コントロールを用いて最初のパイロット実験を実施し、細胞システムやアッセイを最適化することや、既存のCRISPR、RNAi、ORFライブラリーを用いた実験の補完の一環として、バリデーションやレスキュー実験を行うことができます。

今すぐCRISPRスクリーニングを開始しましょう

gRNAが最適化されたSangerライブラリーがあるのに、なぜ偽陽性の結果をトラブルシューティングする必要があるのでしょうか。Sangerライブラリーは広範囲で高品質の遺伝子ノックアウトを提供するため、研究を迅速に進めることができます。

私たちが手掛けるレンチウイルスベースのCRISPRスクリーニングは、実験やアプリケーションにおいて多くの選択肢を提供します。

• 安定または一過性のベクター導入
• 目的細胞集団を増やす（ベクターに組み込まれているpuromycinまたはBFPでのセレクションが可能）
• BFPタグは陽性細胞の可視化を可能にする（図1）
• ウイルスベクターがゲノムに組み込まれるので、安定細胞株が作製できる
• どのような細胞（増殖力が強い細胞および弱い細胞の両方）も形質導入可能になる
• 用途に合わせて、ウイルスタイターの力価をカスタマイズできる

 

図1. Sanger CRISPRレンチウイルスに感染したA549-Cas9-Blast安定発現細胞におけるBFPの発現。感染から7日後、20倍の倍率。

CRISPRの基礎についてご不明な点がございましたら、CRISPR入門をご参照ください。

Sangerライブラリーの仕様

大腸菌グリセロールストック

• 96穴プレート約400枚、50 μL/ウェル
• ヒトまたはマウス

レンチウイルス

• バーコードラベルが貼付された、貫通可能なアルミニウム製シールが施された約100枚の384ウェルCostarプレート
• p24アッセイで測定した1×106 VP/mL以上のタイターで、1クローン（1ウェル）あたり10 uL
• ヒトまたはマウス種

Sanger CRISPR gRNAのデザインとベクターの特長

gRNAデザイン

• タンパク質コード配列の前半を標的とすることにより、遺伝子ノックアウトを最大化
• すべての転写産物を標的するように最適化
• 別の開始コドンがしばしば下流に存在するので、コード配列の最初の90 bpを回避
  
• 多種類の細胞でも使えることを確実にするために、SNPを避けて高度に保存された配列を標的
• 厳格なルールによりオフターゲット効果の可能性を低減または排除

ベクターの特長

• ピューロマイシンのセレクションにより、ワークフローを簡略化
• BFPの発現によってベクター発現細胞を可視化し、形質導入細胞を濃縮
• トランスポザーゼサイトはレンチウイルスによるゲノム導入の代替法として使用可能

図2. SangerレンチウイルスCRISPRのベクターマップ（LV04）

レンチウイルス製造のエキスパート

私たちは、ゲノム編集技術に関わる比類のない製造とサポートを提供することに尽力しています。最先端のロボット工学、リキッド・ハンドリング、LIMS、および専用の研究所により、CRISPR技術を使った研究のニーズに対して優れた品質と便利なサービスを提供します。

高品質の製造システムおよび人員：

• ハイスループット（HT）ロボットハンドリング
• 1Dおよび2Dバーコーディング
• 高度な訓練を受けた専門家で、10年以上のレンチウイルスを使った遺伝子編集の経験がある
  
• ハイスループットなウイルス製造

単一遺伝子の標的から全ゲノムまで

Sangerライブラリーは、全ゲノムをCRISPRノックアウトによって干渉し、便利なアレイ形式での高度な表現型の読み出す両方を可能にする唯一のツールです。スモールスケールな実験の場合は、当社の製造品質とSanger研究所の設計専門知識を存分に活用して、カスタムパネルを構築することも可能です。

より絞った、または手頃な価格のスクリーニングが必要ですか?

• 個別の遺伝子に対してSanger QuickPick^™クローンを選択する
• ご希望のカスタムパネルを選ぶ
  
• Sangerベクターにご希望のgRNA配列を搭載する
• Sangerパネルを用いて任意の経路または遺伝子ファミリーを標的とする

創薬標的候補（Human Druggable） 腫瘍抑制因子 転写因子 がん細胞の生物学 膜タンパク質 エピジェネティクス 細胞周期 キナーゼ GPCR アポトーシス 細胞接着 サイトカインおよびサイトカイン受容体 ユビキチンリガーゼ

ユビキチン酵素 膜輸送 イオンチャンネル DNA修復 プロテアーゼ ホスファターゼ B細胞活性化 T細胞活性化 ヘリカーゼ JAK-STAT阻害薬 ユビキチンプロテアーゼ 核内ホルモン受容体

必要なオプションが表示されませんか。全ゲノムライブラリーから個々のクローンまで、ご希望のgRNAを指定してSangerベクターで製造できます。

Sanger gRNAアプリケーションデータ

Sanger gRNAは最適化されており、強固な遺伝子編集を促進します。CEL-Iアッセイによって得られたインデル検出の結果は、ノックアウトを最大化するように設計されたgRNAが非常に効果的であることを示します。さらに、各遺伝子に2つのgRNAが提供されるため、スクリーニング後の候補遺伝子の層別化が可能となり、効率が最大化され、偽陽性が減少します。

A.

B.

C.

図3. Sanger ライブラリーで得られた細胞は、変異検出のためのCEL-Iアッセイにおいて明確な遺伝子編集を示す。A549-Cas9-Blast細胞をSanger gRNAで感染させ、ピューロマイシンでセレクションをした後に、CEL-Iアッセイに供した。A)ピューロマイシンで4日間セレクションを行った後の細胞増殖、B) Sanger gRNAが導入された細胞からの試料を使って、CEL-Iアッセイを行った。アガロースゲル上で電気泳動を行い、DNA切断効率を評価した代表的な画像（G7-G12では切断が見られるが、コントロール郡では顕著な切断が見られない）、C) 代表的なgRNAクローンのCEL-IアッセイにおけるDNA切断効率（y軸）のプロット（各点は単一クローンを示す）。平均的に高いヌクレアーゼ活性と活性を持ったgRNAが高い頻度で得られたことを示す。

Sangerスクリーニングの設計者が、神経変性疾患の新しい治療法を見つけるためにこのツールをどのように使用しているかご覧ください。

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参考文献

1. Metzakopian E, Strong A, Iyer V, Hodgkins A, Tzelepis K, Antunes L, Friedrich MJ, Kang Q, Davidson T, Lamberth J, et al. 2017. Enhancing the genome editing toolbox: genome wide CRISPR arrayed libraries. Sci Rep. 7(1): https://doi.org/10.1038/s41598-017-01766-5

2. Denis Belitškin D, Pant SM, Munne P, Suleymanova I, Belitškina K, Hongisto H, Englund J, Raatikainen T, Klezovitch O, Vasioukhin V, et al. 2021. Hepsin regulates TGFβ signaling via fibronectin proteolysis. EMBO Rep. 22(11): https://doi.org/10.15252/embr.202152532

3. Turner RJ, Golz S, Wollnik C, Burkhardt N, Sternberger I, Andag U, Cornils H. 2020. A Whole Genome-Wide Arrayed CRISPR Screen in Primary Organ Fibroblasts to Identify Regulators of Kidney Fibrosis. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25(6):591-604. https://doi.org/10.1177/2472555220915851

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