[Przejdź do zawartości](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl) Produkty Koszyk0 PLPL Produkty ProduktyZastosowaniaUsługiZasobyWsparcie [Zaloguj się / Zarejestruj się](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Wyszukiwanie zamówienia](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/order-lookup) [Szybkie zamówienie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/quick-order) Koszyk0 [Strona główna](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/applications/genomics/qpcr)Protokół określania wydajności qPCR # Protokół określania wydajności qPCR ### Przeczytaj o - [Optymalizacja warunków qPCR](https://www.sigmaaldrich.com#optimization). - [Sprzęt](https://www.sigmaaldrich.com#sprz%C4%99t) - [Odczynniki](https://www.sigmaaldrich.com#odczynniki) - [Dostawy](https://www.sigmaaldrich.com#dostawy) - [Method](https://www.sigmaaldrich.com#methods) - [Related Products](https://www.sigmaaldrich.com#products) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Optymalizacja warunków qPCR Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatur wyżarzania. Po zoptymalizowaniu testu ważne jest, aby zweryfikować wydajność reakcji. Informacje te są ważne podczas raportowania i porównywania testów. W tym przykładowym protokole wydajność testu jest porównywana w szerokim i wąskim zakresie dynamicznym stężeń cDNA. W praktyce często wybiera się pojedynczy zakres do testowania w zależności od oczekiwanego zakresu celu w próbkach, więc podany protokół można dostosować do wymagań eksperymentu. W tym przykładzie wydajność jest obliczana przy użyciu zarówno 10-krotnych, jak i 2-krotnych serii rozcieńczeń. Krzywa standardowa powinna obejmować oczekiwany zakres ekspresji dla interesujących genów Należy zauważyć, że proporcjonalność wydajności cDNA w odniesieniu do wejściowego RNA jest liniowa podczas korzystania z zestawu ReadyScript® RT, więc ten eksperyment można dostosować do RT-qPCR, jeśli używa się tego systemu poprzez 1) rozcieńczenie RNA i przeprowadzenie reakcji RT, a następnie 2) przeprowadzenie qPCR na każdej z powstałych próbek cDNA (patrz [Reverse Transcription](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription) dla przykładów).Nie zawsze jednak tak jest i nie dotyczy to wszystkich zestawów lub protokołów odwrotnej transkrypcji. Należy to zweryfikować przed dostosowaniem tego protokołu do alternatywnego zestawu  ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Equipment - Quantitative PCR instrument - Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Odczynniki - DNA do wykorzystania jako szablon krzywej standardowej (np.g., cDNA, gDNA lub szablon syntetyczny). - KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ ([KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/KCQS00) - PCR grade water: Woda klasy PCR ([W1754](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/W1754) lub [W4502](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/W4502)) jako 20 ml podwielokrotności; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności dla każdej reakcji. - Startery do przodu i do tyłu dla badanych genów (zapas 10 μM). Hot Start ReadyMixes (Taq, Buffer, dNTPs, Reference Dye, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ([Cat. No. KCQS00](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/KCQS00))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox ([Nr kat. No. KCQS01](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/KCQS01))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ with ROX ([Nr kat. No. KCQS02](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/KCQS02))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ ([Nr kat. No. KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/KCQS03)) __Kompatybilne urządzenia:____Kompatybilne instrumenty:____Kompatybilne instrumenty:____Kompatybilne instrumenty:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700 Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900 Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler® 480 Tabela 1.Przewodnik wyboru SYBR® Green PCR Mix™. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Dostawy - Filtr sterylny [końcówki do pipet](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Sterylne 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/CLS430909) - Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z nich, aby dopasować żądany format: \-    Pojedyncze cienkościenne probówki do PCR o pojemności 200 μL ([Z374873](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/Z374873)) \-    Płytki       - [Płytki 96-dołkowe (Z374903)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/Z374903)      - [.Płytki 384-dołkowe (Z374911)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/Z374911) \-    Uszczelki do płytek       - [Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/Z734438)       - [Folia ThermSeal RT2RR™ (Z722553)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/Z722553) ### Uwagi do tego protokołu - cDNA jest generowane przy użyciu losowego primingu lub metody oligo-dT (patrz [Standardowy protokół odwrotnej transkrypcji (dwuetapowy)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step)). Produkt RT jest rozcieńczany w celu przygotowania krzywych standardowych (jako przykłady podano 1:2 i 1:10). RNA można również rozcieńczyć i zsyntetyzować cDNA z każdego rozcieńczenia przy użyciu zestawu ReadyScript® lub zastosować jednoetapowe podejście RT-qPCR, rozcieńczając RNA i postępując zgodnie z jednoetapowym podejściem RT-qPCR w Protokół odwrotnej transkrypcji (jednoetapowy SYBR® Green I Dye Detection) oraz [Protokół odwrotnej transkrypcji (jednoetapowe wykrywanie sondy)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/reverse-transcription-one-step-probe-detection). Alternatywnie, szablony DNA można zastąpić w taki sposób, aby oczekiwany zakres Cq mieścił się w zakresie od Cq 15 do Cq 38. - Każde stężenie seryjnych rozcieńczeń zostanie przeprowadzone jako zduplikowane reakcje. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Metoda 1.    Przygotuj mieszaninę wzorcową qPCR wystarczającą na 40 reakcji zgodnie z __Tabelą 2__. Pozwala to na uwzględnienie dodatkowych błędów pipetowania, ponieważ zostaną przeprowadzone 32 reakcje (__Tabela 3__). OdczynnikiObjętość (μL) na pojedynczą reakcję 20 μLObjętość (μL) dla 40 reakcji 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™10400 Starter do przodu (10 μM)0.936 Reverse primer (10 μM)0.936 PCR grade water3.2128 Tabela 2.Mieszanina wzorcowa do generowania krzywej wzorcowej 1:2 i 1:10. 2.    Rozcieńczyć DNA w serii 1:10 i 1:2 obejmującej 7 punktów rozcieńczenia dla każdej serii  (__Tabela 3__, Układ płytki do rozcieńczania DNA). 3.    Dodaj 5 μL odpowiedniego rozcieńczenia szablonu do określonych dołków (__Tabela 3__, Układ płytki do rozcieńczania DNA). Układ płytki do rozcieńczania DNA Płytka Kolumna1234Reszta płytki A1111 B0.10.10.50.5 C0.010.010.250.25 D0.0010.0010.1250.125 E0.00010.00010.06250.0625 F0.000010.000010.031250.03125 G0.0000010.0000010.0156250.015625 HNTCNTCNTCNTC Tabela 3. Schemat pierwszych czterech kolumn układu płytki 96-dołkowej pokazujący położenie rozcieńczeń szablonu krzywej wzorcowej. Podane rozcieńczenie odnosi się do oryginalnego roztworu podstawowego. W przypadku korzystania ze sztucznej matrycy możliwe jest obliczenie liczby kopii (w odniesieniu do odczytów OD). 4.    Dodaj 15 μL mieszaniny wzorcowej do każdej studzienki (__Tabela 3__). 5.    Zakryj probówki lub uszczelnij płytkę i opatrz etykietą. (Upewnij się, że etykiety nie zasłaniają wzbudzenia/detekcji urządzenia      ścieżki światła). 6.    Uruchom próbki zgodnie z poniższym dwuetapowym protokołem. Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli. Śledź        amplifikację ze standardową analizą krzywej dysocjacji. . | | | | |--------------------------------------------|-----------|-------------| | Cycling Conditions | Temp (°C) | Czas (sek.) | | Denaturacja początkowa/Hot Start | 95 | 30 | | __Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli__ | | | | Krok 1 | 95 | 5 | | Krok 2 | 60 | 30 | Tabela 4.Warunki cyklu PCR dla generowania krzywej standardowej. *__Uwaga:__* Użyj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych). ## Powiązane produkty Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd Response not successful: Received status code 500 __Powiązane artykuły__ - [Projektowanie testów PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [Optymalizacja i walidacja testów PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [Synteza oligonukleotydów DNA](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis) - [Zablokowany kwas nukleinowy i drobne spoiwo / Eclipse Dark Quencher](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq) - [Kwantyfikacja oligonukleotydów](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/quantitation-of-oligos) - [Rozwiązywanie problemów z RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [Rozwiązywanie problemów z amplifikacją PCR i RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting-pcr-and-rt-pcr-amplification) - [Analiza macierzowa CGH trudnych próbek](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/array-cgh-analysis) - [Zobacz więcej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Powiązane kategorie produktów__ - [Folie i taśmy uszczelniające](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Końcówki do pipet](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Oligonukleotydy DNA na zamówienie i sondy do qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes/custom-predesigned-dna-oligos-and-qpcr-probes) - [Oligosy, sondy qPCR i peptydy](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes) Góra __Zaloguj się, aby kontynuować__ Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować. Zaloguj się__Nie masz konta użytkownika?__Zarejestruj Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim. Wsparcie[Obsługa klienta](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/support/customer-support)[Kontakt](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/collections/offices)[FAQ](https://maestro.my.site.com/knowledgeportal/s/)[Karty charakterystyki (SDS)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/documents-search?tab=sds)[Certyfikaty (COA/COO)](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/documents-search?tab=coa)[Jakość i przepisy](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/quality-and-regulatory-management)[Kalkulatory i aplikacje](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/support/calculators-and-apps)[Webinaria](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/collections/webinars) Zamówienia[Wyszukiwanie zamówień](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/order-lookup)[Szybkie zamówienie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/quick-order)[Produkty niestandardowe](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/services/custom-products)[Rozwiązania eCommerce](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/ecommerce/ecommerce-solutions) Firma[O nas](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/about-us)[Odpowiedzialność](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/ssbi)[Wydarzenia](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/collections/events)[Komunikaty prasowe](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/collections/press)[Programy](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/partnership-programs)[Kariera](https://careers.merckgroup.com/global/en)[Biura](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/collections/offices) Media społecznościowe [](https://www.linkedin.com/company/merck-life-science) [](https://x.com/Merck_lifesci) [](https://www.facebook.com/Merck.lifescience) [](https://www.instagram.com/mercklifescience/) [](https://www.youtube.com/@MerckLifeScience/featured) Merck __Badania. Rozwój. Produkcja.__ Jesteśmy wiodącym dostawcą dla globalnej branży Life Science, oferującym rozwiązania i usługi w zakresie badań, rozwoju i produkcji biotechnologicznej oraz rozwoju i produkcji leków farmaceutycznych. [](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl) [Rozwiązania Sigma-Aldrich®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/sigma-aldrich)[Rozwiązania BioReliance®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/bioreliance)[Roztwory Millipore®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/millipore)[Rozwiązania SAFC®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/safc)[Rozwiązania Milli-Q®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/milliq)[Rozwiązania Supelco®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/supelco) © 2026 Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy i/lub jej podmioty stowarzyszone. Wszelkie prawa zastrzeżone, w tym eksploracja tekstu i danych na potrzeby szkolenia w zakresie sztucznej inteligencji i podobnych technologii. Powielanie jakichkolwiek materiałów ze strony jest surowo zabronione bez zezwolenia. [Warunki korzystania z witryny](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/legal/site-use-terms)|[Polityka prywatności](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/legal/privacy-statement)|[Ogólne warunki sprzedaży](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/legal/terms-and-conditions)|[Zgoda na prawa autorskie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/life-science/legal/copyright-consent)|[Mapa witryny](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/site-map)