Protokół określania wydajności qPCR
Przeczytaj o
Optymalizacja warunków qPCR
Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatur wyżarzania.
Po zoptymalizowaniu testu ważne jest, aby zweryfikować wydajność reakcji. Informacje te są ważne podczas raportowania i porównywania testów. W tym przykładowym protokole wydajność testu jest porównywana w szerokim i wąskim zakresie dynamicznym stężeń cDNA. W praktyce często wybiera się pojedynczy zakres do testowania w zależności od oczekiwanego zakresu celu w próbkach, więc podany protokół można dostosować do wymagań eksperymentu. W tym przykładzie wydajność jest obliczana przy użyciu zarówno 10-krotnych, jak i 2-krotnych serii rozcieńczeń. Krzywa standardowa powinna obejmować oczekiwany zakres ekspresji dla interesujących genów Należy zauważyć, że proporcjonalność wydajności cDNA w odniesieniu do wejściowego RNA jest liniowa podczas korzystania z zestawu ReadyScript® RT, więc ten eksperyment można dostosować do RT-qPCR, jeśli używa się tego systemu poprzez 1) rozcieńczenie RNA i przeprowadzenie reakcji RT, a następnie 2) przeprowadzenie qPCR na każdej z powstałych próbek cDNA (patrz Reverse Transcription dla przykładów).Nie zawsze jednak tak jest i nie dotyczy to wszystkich zestawów lub protokołów odwrotnej transkrypcji. Należy to zweryfikować przed dostosowaniem tego protokołu do alternatywnego zestawu
Equipment
- Quantitative PCR instrument
- Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie)
Odczynniki
- DNA do wykorzystania jako szablon krzywej standardowej (np.g., cDNA, gDNA lub szablon syntetyczny).
- KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03
- PCR grade water: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) jako 20 ml podwielokrotności; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności dla każdej reakcji.
- Startery do przodu i do tyłu dla badanych genów (zapas 10 μM).
| Hot Start ReadyMixes (Taq, Buffer, dNTPs, Reference Dye, MgCl2) | |||
|---|---|---|---|
| KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (Cat. No. KCQS00) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (Nr kat. No. KCQS01) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ with ROX (Nr kat. No. KCQS02) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ (Nr kat. No. KCQS03) |
| Kompatybilne urządzenia: | Kompatybilne instrumenty: | Kompatybilne instrumenty: | Kompatybilne instrumenty: |
| Bio-Rad CFX384™ | Applied Biosystems 7500 | Applied Biosystems 5700 | Bio-Rad iCycler iQ™ |
| Bio-Rad CFX96™ | Applied Biosystems 7500 | Applied Biosystems 7000 | Bio-Rad iQ™5 |
| Bio-Rad MiniOpticon™ | Fast Applied Biosystems ViiA 7 | Applied Biosystems 7300 | Bio-Rad MyiQ™ |
| Bio-Rad MyiQ™ | Stratagene Mx3000P® | Applied Biosystems 7700 | |
| Bio-Rad/MJ Chromo4™ | Stratagene Mx3005P™ | Applied Biosystems 7900 | |
| Bio-Rad/MJ Opticon 2 | Stratagene Mx4000™ | Applied Biosystems 7900 HT Fast | |
| Bio-Rad/MJ Opticon® | Applied Biosystems 7900HT | ||
| Cepheid SmartCycler® | Applied Biosystems StepOnePlus™ | ||
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex | Applied Biosystems StepOne™ | ||
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s | |||
| Illumina Eco qPCR | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q | |||
| Roche LightCycler® 480 | |||
Dostawy
- Filtr sterylny końcówki do pipet
- Sterylne 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909)
- Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z nich, aby dopasować żądany format:
- Pojedyncze cienkościenne probówki do PCR o pojemności 200 μL (Z374873)
- Płytki
- Płytki 96-dołkowe (Z374903)
- .Płytki 384-dołkowe (Z374911)
- Uszczelki do płytek
- Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)
- Folia ThermSeal RT2RR™ (Z722553)
Uwagi do tego protokołu
- cDNA jest generowane przy użyciu losowego primingu lub metody oligo-dT (patrz Standardowy protokół odwrotnej transkrypcji (dwuetapowy)). Produkt RT jest rozcieńczany w celu przygotowania krzywych standardowych (jako przykłady podano 1:2 i 1:10). RNA można również rozcieńczyć i zsyntetyzować cDNA z każdego rozcieńczenia przy użyciu zestawu ReadyScript® lub zastosować jednoetapowe podejście RT-qPCR, rozcieńczając RNA i postępując zgodnie z jednoetapowym podejściem RT-qPCR w Protokół odwrotnej transkrypcji (jednoetapowy SYBR® Green I Dye Detection) oraz Protokół odwrotnej transkrypcji (jednoetapowe wykrywanie sondy). Alternatywnie, szablony DNA można zastąpić w taki sposób, aby oczekiwany zakres Cq mieścił się w zakresie od Cq 15 do Cq 38.
- Każde stężenie seryjnych rozcieńczeń zostanie przeprowadzone jako zduplikowane reakcje.
Metoda
1. Przygotuj mieszaninę wzorcową qPCR wystarczającą na 40 reakcji zgodnie z Tabelą 2. Pozwala to na uwzględnienie dodatkowych błędów pipetowania, ponieważ zostaną przeprowadzone 32 reakcje (Tabela 3).
| Odczynniki | Objętość (μL) na pojedynczą reakcję 20 μL | Objętość (μL) dla 40 reakcji |
|---|---|---|
| 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ | 10 | 400 |
| Starter do przodu (10 μM) | 0.9 | 36 |
| Reverse primer (10 μM) | 0.9 | 36 |
| PCR grade water | 3.2 | 128 |
2. Rozcieńczyć DNA w serii 1:10 i 1:2 obejmującej 7 punktów rozcieńczenia dla każdej serii (Tabela 3, Układ płytki do rozcieńczania DNA).
3. Dodaj 5 μL odpowiedniego rozcieńczenia szablonu do określonych dołków (Tabela 3, Układ płytki do rozcieńczania DNA).
| Układ płytki do rozcieńczania DNA | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Płytka Kolumna | 1 | 2 | 3 | 4 | Reszta płytki |
| A | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| B | 0.1 | 0.1 | 0.5 | 0.5 | |
| C | 0.01 | 0.01 | 0.25 | 0.25 | |
| D | 0.001 | 0.001 | 0.125 | 0.125 | |
| E | 0.0001 | 0.0001 | 0.0625 | 0.0625 | |
| F | 0.00001 | 0.00001 | 0.03125 | 0.03125 | |
| G | 0.000001 | 0.000001 | 0.015625 | 0.015625 | |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | |
4. Dodaj 15 μL mieszaniny wzorcowej do każdej studzienki (Tabela 3).
5. Zakryj probówki lub uszczelnij płytkę i opatrz etykietą. (Upewnij się, że etykiety nie zasłaniają wzbudzenia/detekcji urządzenia
ścieżki światła).
6. Uruchom próbki zgodnie z poniższym dwuetapowym protokołem. Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli. Śledź
amplifikację ze standardową analizą krzywej dysocjacji.
.
| Cycling Conditions | Temp (°C) | Czas (sek.) |
|---|---|---|
| Denaturacja początkowa/Hot Start | 95 | 30 |
| Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli | ||
| Krok 1 | 95 | 5 |
| Krok 2 | 60 | 30 |
Uwaga: Użyj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych).
Powiązane produkty
Response not successful: Received status code 500
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.