Verfahren zum Nachweis von an Membranen gebundene Proteine und Nukleinsäuren

Verschiedene Nachweisverfahren werden eingesetzt, um die Nukleinsäuren und bestimmten Proteine, die an den Membranträger übertragen wurden, zu veranschaulichen. Southern und Northern Blot involvieren die Verwendung von radioaktiven Sonden. Der Nachweis involviert das Aussetzen gegenüber Röntgenstrahlung oder einem Autoradiographiefilm im Dunkeln. Beim Western Blot können die Proteine auf der Nitrocellulosemembran mittels Kolorimetrie-, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenztechniken nachgewiesen werden.

Western-Blot-Nachweisverfahren

Kolorimetrischer Nachweis

Prinzip: Die häufig eingesetzten Nachweisverfahren involvieren die Verwendung von proteinspezifischen Primärantikörpern, gefolgt von einem Nachweis mit Sekundärantikörpern, die entweder an das HRP(Meerrettichperoxidase)- oder AP-Enzym (alkalische Phosphatase) konjugiert sind. Wenn das chromogene Substrat zugegeben wird, katalysiert das Enzym eine Reaktion und erzeugt eine farbige Ausfällung, die auf dem Blot abgeschieden wird. Diese Ausfällung ist gut sichtbar und kann fotografiert werden.

Abbildung 1. Kolorimetrischer Nachweis von Proteinen auf einer Membran

Meerrettichperoxidase(HRP)-System Die mit HRP kompatiblen Substrate sind 4-Chlor-1-naphthol (4-CN; C8302), 3,3‘-Diaminobenzidin (DAB; D5905) und 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin (TMB; T0565).

In Gegenwart von Wasserstoffperoxid macht an den Sekundärantikörper konjugierte HRP Folgendes:

• oxidiert 4-CN zu einer bläulich-violetten 4-Chlor-1-naphthonausfällung
• polymerisiert DAB zu einer komplexen braunen Ausfällung
• oxidiert TMB zu einer dunkelblauen TMB-Diimin-Ausfällung

Alkalisches Phosphatase-System (AP): Das mit AP kompatible Substrat ist die Kombination aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP^®) und Nitroblautetrazolium (NBT) (B5655, B6404, B6777, B1911)

Die Veranschaulichung eines Proteins auf Western Blot mit einem an AP konjugierten Sekundärantikörper involviert die Vollendung einer zweistufigen Reaktion mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblautetrazolium (NBT). AP katalysiert die Bildung eines Bromchlorindoxyl-Zwischenprodukts durch Dephosphorylierung. NBT oxidiert das Indoxyl, um eine violette Ausfällung zu bilden und wird im Gegenzug zu einer unlöslichen, blauen Diformazanausfällung reduziert. Die Kombination aus beiden Ausfällungen resultiert in einer sichtbaren blau-violetten Ausfällung auf dem Blot an der Stelle des Proteins von Interesse.

Abbildung 2. Strukturen der Nachweisverfahren

Chemilumineszenz-Nachweis

Prinzip: Chemilumineszenz ist ein Verfahren, bei dem eine chemische Reaktion mit einem Stoff zu der Freisetzung von Energie in Form von Licht führt. Das emittierte Licht kann auf einem Röntgenfilm festgehalten werden. Dieses am häufigsten eingesetzte Nachweisverfahren involviert den Nachweis mit Sekundärantikörpern, die entweder an HRP (Meerrettichperoxidase) oder AP (alkalische Phosphatase) konjugiert sind.

Abbildung 3. Chemilumineszenz-Nachweis von Proteinen auf einer Membran

Meerrettichperoxidase-Luminol-System: Luminol ist ein chemilumineszentes Substrat von HRP. In Gegenwart von Peroxid oxidiert HRP Luminol zu einem angeregten Produkt namens 3-Aminophthalat, das Licht bei 425 nm emittiert. Die Emission erfolgt so lange, bis das 3-Aminophthalat zerfällt und in den Grundzustand eintritt. Das emittierte Licht kann auf einer CCD-Kamera oder durch Aussetzen gegenüber einem Röntgenfilm festgehalten werden.

Alkalisches-Phosphatase(AP)-CDP-Star® System: CDP-Star^® (Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetan-3,2‘-(5‘-chlor)tricyclo[3.3.1.1^3,7]decan}-4-yl)-1-phenylphosphat) ist ein chemilumineszentes Substrat von AP. CDP-Star^® wird durch AP dephosphoryliert, um ein metastabiles Dioxetanphenolatanion zu erzeugen, das Licht bei 466 nm emittiert. Das emittierte Licht ist bis zu 24 Stunden stabil, wodurch mehrere Aussetzungen gegenüber Röntgenfilm möglich sind.

Unser Angebot umfasst eine Reihe von Sekundärantikörpern, die a HRP- und AP-Enzyme konjugiert sind. Die Sekundärantikörper können mit den folgenden Nachweisreagenzien in Western Blot eingesetzt werden.

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Fluoreszenz-Nachweis

Prinzip: Das Protein von Interesse auf Western Blot kann auch mit an Fluoreszenzfarbstoffe konjugierten Primär- und Sekundärantikörpern nachgewiesen werden. Die Farbstoffe fluoreszieren bei einer bestimmten Wellenlänge und können durch eine Abbildung des Blots nachgewiesen werden.

Abbildung 4. Fluoreszenz-Nachweis von Proteinen auf einer Membran

Unser Angebot umfasst eine Reihe von Sekundärantikörpern, die an verschiedene fluoreszierende Atto-Farbstoffe konjugiert sind. Sie eignen sich am besten für Multiplex-Immunblotting, wobei zwei an Atto-Farbstoffe konjugierte Sekundärantikörper verschiedene Anregungs-/Emissionswellenlängen verwenden. Multiplexen mit an Atto-Farbstoffe konjugierten Sekundärantikörpern ist anwendbar, um ein bestimmtes Protein im phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Zustand nachzuweisen.

Weitere Details zu Multiplex-Immunblotting finden Sie hier.

Nachweisverfahren mit Southern und Northern Blot

Southern und Northern Blot involvieren die Verwendung von radioaktiven Sonden. Der Nachweis involviert das Aussetzen gegenüber Röntgenstrahlung oder einem Autoradiographiefilm im Dunkeln. Es gibt jedoch Chemilumineszenzsubstrate, die zum Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden können, die auf eine Nylonmembran übertragen wurden..

Chemilumineszenz-Nachweis

Für den Chemilumineszenz-Nachweis von Nukleinsäuresonden ist es erforderlich, die Membran 60 min in Blocking-Puffer (B6429, C7594, G7663) zu inkubieren.

HRP-Luminol-System: Die Umsetzung von HRP mit Luminol kann auch für den Nachweis von Nukleinsäuren in Southern und Northern Blot angewandt werden. Die DNA- und RNA-Sonden können in einer einfachen Markierungsreaktion mit HRP markiert werden. Die markierte Sonde kann ohne weitere Aufreinigung verwendet werden. Die Sonde kann durch die lichterzeugende Umsetzung von HRP mit Luminol auf dem Blot nachgewiesen werden.

CDP-Star^®-System: Die DNA- und RNA-Sonden können in einer einfachen Markierungsreaktion mit CDP-Star^® mit thermostabiler alkalischer Phosphatase markiert werden. Die markierte Sonde kann ohne weitere Aufreinigung verwendet werden. Die Hybridisierungsstringenz kann durch die Temperatur sowie die Salzkonzentration gesteuert werden.

Unser Angebot umfasst chemilumineszente Nachweisreagenzien für Southern und Northern Blot.

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Röntgenfilme für den Nachweis

Unser Angebot umfasst ein breites Spektrum von Röntgenfilmen für den Chemilumineszenz-Nachweis von Proteinen auf Western Blot. Sie sind in verschiedenen praktischen Packungsgrößen erhältlich.Die beliebtesten Packungsgrößen von Carestream Kodak Biomax-Filmen sind nachstehend aufgelistet.

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Der Nachweis einer radioaktiven Sonde in Southern und Northern Blot erfolgt durch das Aussetzen der Sonde gegenüber einem Röntgenfilm bei -80 °C. Für den Nachweis mit Southern und Northern Blot umfasst unser Angebot die folgenden Röntgenfilme in verschiedenen praktischen Packungsgrößen. Die beliebtesten Packungsgrößen von Carestream Kodak Biomax-Filmen sind nachstehend aufgelistet.

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Protokolle für den Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren

Chromogener Nachweis von Proteinen

Nachweis mit 4-CN-Lösung:

• Inkubieren Sie den Blot nach Abschluss des Western Blots in Blocking-Puffer und Primärantikörper.
  
• Inkubation des Blots mit Sekundärantikörper, der mit entweder HRP oder AP markiert ist.
  
• Die Inkubationszeit ist von dem Protein von Interesse und der Konzentration der verwendeten Antikörper abhängig.
  
• Platzieren Sie den Blot auf einer sauberen, flachen Oberfläche.
  
• Stellen Sie die Substratlösung her, indem Sie 4-CN mit Wasserstoffperoxid kombinieren, sodass die Endkonzentration des Peroxids 0,01 % beträgt.
  
• Bedecken Sie die gesamte Blot-Oberfläche bei Raumtemperatur für 1–5 min gleichmäßig mit Substratlösung.
  
• Sobald sich die gewünschte Farbintensität entwickelt hat, beenden Sie die Reaktion, indem Sie den Blot mit Wasser waschen.
  
• Erhalten Sie eine Abbildung des Blots.

Nachweis mit DAB:

• Inkubieren Sie den Blot nach Abschluss des Western Blots in Blocking-Puffer und Primärantikörper.
• Inkubation des Blots mit Sekundärantikörper, der mit entweder HRP oder AP markiert ist.
• Die Inkubationszeit ist von dem Protein von Interesse und der Konzentration der verwendeten Antikörper abhängig.
• Platzieren Sie den Blot auf einer sauberen, flachen Oberfläche.
• Stellen Sie die Substratlösung her, indem Sie eine Tablette DAB in 15 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit pH-Wert 7,6 lösen. Geben Sie direkt vor dem Gebrauch 12 µl frisches 30%iges Wasserstoffperoxid zu. Die Konzentrationen von DAB und Peroxid können nach Bedarf angepasst werden.
• Bedecken Sie die gesamte Blot-Oberfläche bei Raumtemperatur für 1–5 min gleichmäßig mit Substratlösung.
• Sobald sich die gewünschte Farbintensität entwickelt hat, beenden Sie die Reaktion, indem Sie den Blot mit Wasser waschen.
• Erhalten Sie eine Abbildung des Blots.

Nachweis mit TMB:

• Inkubieren Sie den Blot nach Abschluss des Western Blots in Blocking-Puffer und Primärantikörper.
• Inkubation des Blots mit Sekundärantikörper, der mit entweder HRP oder AP markiert ist.
• Die Inkubationszeit ist von dem Protein von Interesse und der Konzentration der verwendeten Antikörper abhängig.
• Platzieren Sie den Blot auf einer sauberen, flachen Oberfläche.
• Bedecken Sie die gesamte Blot-Oberfläche bei Raumtemperatur für 5–15 min gleichmäßig mit TMB-Lösung.
• Sobald sich die gewünschte Farbintensität entwickelt hat, beenden Sie die Reaktion, indem Sie den Blot mit hochreinem Wasser waschen.
• Erhalten Sie eine Abbildung des Blots.

Nachweis mit BCIP^®/NBT:

• Inkubieren Sie den Blot nach Abschluss des Western Blots in Blocking-Puffer und Primärantikörper.
• Inkubieren Sie den Blot mit Sekundärantikörper, der mit entweder HRP oder AP markiert ist.
• Die Inkubationszeit ist von dem Protein von Interesse und der Konzentration der verwendeten Antikörper abhängig.
• Platzieren Sie den Blot auf einer sauberen, flachen Oberfläche.
• Bedecken Sie die gesamte Blot-Oberfläche bei Raumtemperatur für 1–5 min gleichmäßig mit BCIP^®/NBT-Lösung.
• Sobald sich die gewünschte Farbintensität entwickelt hat, beenden Sie die Reaktion, indem Sie den Blot mit Wasser oder 1%iger Essigsäurelösung waschen.
• Erhalten Sie eine Abbildung des Blots.

Chemilumineszenz-Nachweis von Proteinen

• Inkubieren Sie den Blot nach Abschluss des Western Blots in Blocking-Puffer und Primärantikörper.
• Inkubation des Blots mit Sekundärantikörper, der mit entweder HRP oder AP markiert ist.
• Die Inkubationszeit ist von dem Protein von Interesse und der Konzentration der verwendeten Antikörper abhängig.
• Platzieren Sie den Blot auf einer sauberen, flachen Oberfläche.
• Stellen sie das Chemilumineszenz-Reagens her, indem Sie gleiche Volumen Luminolreagens und Oxidationsmittel in einem Becherglas mischen. Schütten Sie diese Mischung auf einen Blot und inkubieren Sie etwa 1 min bei sanftem Schütteln.
• Entfernen Sie das überschüssige Chemilumineszenz-Reagens, indem Sie den Blot mit Löschpapier abtupfen.
• Geben Sie den Blot in eine Dunkelkammer.
• Platzieren Sie den Blot zwischen zwei Schichten Frischhaltefolie in einer Filmkassette. Entfernen Sie gegebenenfalls Luftblasen.
• Platzieren Sie einen Röntgenfilm auf dem Blot, belichten Sie ihn etwa 30 Sekunden und entwickeln Sie ihn.
• Passen Sie die Belichtungszeit für einen optimalen Nachweis nach Bedarf an.

Chemilumineszenz-Nachweis von Nukleinsäuren

Das vorstehende Protokoll kann auch verwendet werden, wenn Chemilumineszenz-Reagenzien für den Nachweis von Nukleinsäuren auf Southern oder Northern Blot eingesetzt werden.

Literatur

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.