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Séquençage

La possibilité de déterminer la composition et l'ordre des acides nucléiques sur un brin d'ADN ou d'ARN joue un rôle majeur dans les études de génétique moderne et dans de nombreux autres domaines. C'est une composante essentielle de la recherche sur les maladies et de la compréhension de tous les organismes. La possibilité de séquencer les acides nucléiques sert non seulement à déchiffrer le code génétique d'un organisme, mais constitue également un outil puissant qui, associé à d'autres technologies moléculaires, permet aux chercheurs de manipuler facilement les séquences d'ADN et de vérifier les modifications apportées par séquençage. Si l'ADN codant est le code qui permet de fabriquer les protéines, les chercheurs peuvent désormais concevoir des protéines recombinantes sur mesure qui contiennent une multitude d'éléments fonctionnels et qui sont couramment utilisées pour répondre à un grand nombre de questions scientifiques importantes. Pour découvrir d'autres réactifs et accéder à des ressources complémentaires sur le séquençage pangénomique, rendez-vous sur la page Séquençage de nouvelle génération.

Méthode de Sanger

À l'origine, la composition en acides nucléiques était déterminée par des techniques de chimie analytique. Mais Fred Sanger et ses collègues ont mis au point des méthodes (initialement avec des fragments digérés radiomarqués et une séparation en deux dimensions) qui ont permis d'obtenir les premières séquences d'acide nucléique complètes. Pendant plusieurs décennies, ces méthodes ont été perfectionnées, chaque amélioration contribuant à la constitution d'une banque toujours plus fournie de protéines et de génomes séquencés. Citons, parmi ces améliorations, la séparation des nucléotides selon leur taille, par électrophorèse sur gel, puis électrophorèse capillaire. De même, l'incorporation de nucléotides marqués par un colorant fluorescent et l'analyse informatique automatisée de chaque fragment d'acide nucléique font désormais partie de la méthode moderne de séquençage de Sanger.

Méthodes de séquençage de l'ADN

Si les technologies de séquençage de l'ADN ne cessent de s'améliorer depuis les premiers pas de cette méthode, plusieurs éléments de base demeurent nécessaires et sont utilisés par les plateformes de séquençage modernes. La préparation de l'ADN comprend généralement son isolement à partir de l'organisme hôte et sa purification. D'autres éléments essentiels, dont les bases azotées libres, les amorces ADN, les bases azotées modifiées (terminateurs de chaîne) marquées en fluorescence et l'ADN polymérase, sont ajoutés ensemble dans un même réacteur. Par une série d'étapes de chauffage et de refroidissement de ce réacteur, tous les éléments ci-dessus s'associent pour produire une banque de petites séquences d'ADN apparentées à la séquence complète d'intérêt, chacune se terminant par un nucléotide terminateur de chaîne marqué en fluorescence à son extrémité. Les nouveaux brins d'ADN contenant les nucléotides marqués en fluorescence à leur extrémité sont séparés selon leur longueur, passés à travers des tubes capillaires et classés par taille. Un laser est alors utilisé pour exciter la base fluorescente de chaque brin tandis qu'une caméra capte le signal. Enfin, un ordinateur est généralement utilisé pour assembler les informations recueillies et reconstituer la séquence d'ADN complète.


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