[Ugrás a tartalomra](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu) Termékek Kosár0 HUHU Termékek [Bejelentkezés / Regisztráció](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Megrendelés keresése](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/order-lookup) [Gyors rendelés](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/quick-order) Kosár0 [Kezdőlap](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu)[Szekvenálás](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/applications/genomics/sequencing)Sanger szekvenálás lépései és módszere # Sanger szekvenálás lépései és módszere __A szakasz áttekintése__ - [Mi a Sanger-szekvenálás?](https://www.sigmaaldrich.com#what) - [Hogyan működik a Sanger-szekvenálás?](https://www.sigmaaldrich.com#how) - [Sanger szekvenálás lépései](https://www.sigmaaldrich.com#sanger) - [Hogyan olvassa le a Sanger-szekvenálás eredményeit](https://www.sigmaaldrich.com#read) - [Sanger-szekvenálás vs. PCR](https://www.sigmaaldrich.com#sequencing) - [Kapcsolódó termékek](https://www.sigmaaldrich.com#term%C3%A9kek) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Mi a Sanger-szekvenálás? A Sanger-szekvenálás, más néven "láncvégződési módszer" a DNS nukleotidszekvenciájának meghatározására szolgáló módszer. A módszert a kétszeres Nobel-díjas Frederick Sanger és munkatársai fejlesztették ki 1977-ben, innen ered a Sanger-szekvencia elnevezés. A DNS általános szerkezetének áttekintéséhez lásd __2. ábra__. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Hogyan működik a Sanger-szekvenálás? A Sanger-szekvenálás végezhető manuálisan vagy, ami még gyakoribb, automatizált módon, szekvenálógépen keresztül (__1. ábra__). Mindegyik módszer három alapvető lépést követ, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. ![Automatizált Sanger-szekvenálás.](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/sequencing/sanger-sequencing_steps_process_diagram.png "Automatizált Sanger-szekvenálás.") __1. ábra.__Az automatizált Sanger-szekvenálás három alapvető lépése. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Sanger szekvenálás lépései A Sanger szekvenálásnak három fő lépése van. ### 1. DNS-szekvencia a láncvégződéses PCR-hez Az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvenciát sablonként használják egy speciális típusú [PCR](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification) úgynevezett láncvégződéses PCR. A láncvégződéses PCR ugyanúgy működik, mint a standard PCR, de egy lényeges különbséggel: módosított nukleotidok (dNTP-k), úgynevezett dideoxiribonukleotidok (ddNTP-k) hozzáadásával. A standard PCR hosszabbítási lépése során a DNS-polimeráz dNTP-ket ad a növekvő DNS-szálhoz azáltal, hogy foszfodiészterkötés kialakulását katalizálja az utolsó nukleotid szabad 3'-OH csoportja és a következő 5'-foszfátja között (__2. ábra__). A láncvégződéses PCR-ben a felhasználó a PCR-reakcióban a normál dNTP-khez kis arányban kever láncvégződéses ddNTP-ket. A ddNTP-kből hiányzik a foszfodiészterkötés kialakításához szükséges 3'-OH csoport; ezért amikor a DNS-polimeráz véletlenszerűen beépít egy ddNTP-t, a hosszabbítás megszűnik. A láncvégződéses PCR eredménye az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia több millió-milliárd oligonukleotid-kópiája, amelyet 5'-ddNTP-kkel véletlenszerű hosszban (n) fejeznek be. In manuális Sanger-szekvenálás során négy PCR-reakciót állítanak be, amelyek mindegyikébe csak egyféle ddNTP-t (ddATP, ddTTP, ddGTP és ddCTP) kevernek. Az automatizált Sanger-szekvenálásban az összes ddNTP-t egyetlen reakcióban keverik össze, és a négy dNTP mindegyike egyedi fluoreszcens jelöléssel rendelkezik. ### 2. Méret szerinti szétválasztás gélelektroforézissel A második lépésben a láncvégződésű oligonukleotidokat gélelektroforézissel méret szerint választjuk szét. A gélelektroforézis során a DNS-mintákat egy gélmátrix egyik végébe töltik, és elektromos áramot alkalmaznak; a DNS negatív töltésű, így az oligonukleotidok a gél ellentétes oldalán lévő pozitív elektróda felé húzódnak. Mivel minden DNS-darab tömegegységenként azonos töltéssel rendelkezik, az oligonukleotidok mozgásának sebességét csak a méret határozza meg. Minél kisebb egy fragmentum, annál kisebb súrlódás éri, amikor a gélen keresztül mozog, és annál gyorsabban fog mozogni. Ennek eredményeképpen az oligonukleotidok a legkisebbtől a legnagyobb felé haladva, a gélt alulról felfelé olvasva helyezkednek el. A manuális Sanger-szekvenálás során a négy PCR-reakcióból származó oligonukleotidokat a gél négy külön sávjában futtatjuk. Ez lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy tudja, hogy melyik oligonukleotidok melyik ddNTP-nek felelnek meg. A automatizált Sanger-szekvenálásban az összes oligonukleotidot egyetlen kapilláris gélelektroforézisben futtatják a szekvenálógépen belül. ### 3. Gélelemzés & A DNS-szekvencia meghatározása Az utolsó lépés egyszerűen a gél leolvasása a bemeneti DNS szekvenciájának meghatározásához. Mivel a DNS-polimeráz csak 5' és 3' irányban szintetizálja a DNS-t egy megadott primerrel kezdve, minden egyes terminális ddNTP egy adott nukleotidnak felel meg az eredeti szekvenciában (pl, a legrövidebb fragmentumnak az 5' végétől számított első nukleotidnál kell végződnie, a második legrövidebb fragmentumnak az 5' végétől számított második nukleotidnál kell végződnie stb.) Ezért a gélsávok legkisebbtől a legnagyobbig történő leolvasásával meghatározhatjuk az eredeti DNS-szál 5' és 3' közötti szekvenciáját. In manuális Sanger-szekvenálás során a felhasználó a gél mind a négy sávját egyszerre olvassa le, alulról felfelé haladva, és a sávok segítségével határozza meg a terminális ddNTP azonosságát az egyes sávokhoz. Ha például az alsó sávot a ddGTP-nek megfelelő oszlopban találjuk, akkor a legkisebb PCR-fragment ddGTP-vel végződik, és az eredeti szekvencia 5' végétől számított első nukleotid guanin (G) bázisú. Az automatizált Sanger-szekvenálásban a számítógép a kapilláris gél minden egyes sávját sorrendben leolvassa, és a fluoreszcencia segítségével minden egyes terminális ddNTP azonosságát megadja. Röviden, egy lézer gerjeszti a fluoreszcens címkéket az egyes sávokban, és a számítógép érzékeli az így kibocsátott fényt. Mivel a négy ddNTP mindegyike más-más fluoreszcens jelöléssel van ellátva, a kibocsátott fény közvetlenül a terminális ddNTP azonosságához köthető. A kimenetet kromatogramnak nevezzük, amely az egyes nukleotidok fluoreszcens csúcsát mutatja a sablon DNS hossza mentén. ![A DNS szerkezetének vázlata. A DNS egy molekula, amely két szálból áll, amelyek egymás köré tekeredve kettős spirált alkotnak. Mindkét szál dezoxiribonukleotidoknak (dNTP-k) nevezett molekulákból áll.](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/sequencing/sanger-sequencing_dna-structure.png "A DNS szerkezetének vázlata. A DNS egy molekula, amely két szálból áll, amelyek egymás köré tekeredve kettős spirált alkotnak. Mindkét szál dezoxiribonukleotidoknak (dNTP-k) nevezett molekulákból áll.") __2. ábra.__A DNS szerkezetének vázlata. A DNS egy molekula, amely két szálból áll, amelyek egymás köré tekeredve kettős spirált alkotnak. Mindkét szál dezoxiribonukleotidoknak (dNTP-k) nevezett molekulákból áll. Minden dNTP tartalmaz egy foszfátcsoportot, egy cukorcsoportot és a négy nitrogénbázis \[adenin (A), timin (T), guanin (G) vagy citozin (C)] egyikét. A dNTP-ket az egyik dNTP cukorcsoportja és a következő dNTP foszfátcsoportja közötti foszfodiészter kovalens kötések fűzik egymáshoz lineárisan; ez az ismétlődő cukor-foszfát minta alkotja a cukor-foszfát gerincet. A két különálló szál nitrogénbázisai a komplementer bázisok közötti hidrogénkötésekkel kapcsolódnak egymáshoz, így alakul ki a kettős szálú DNS-helix. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Hogyan olvassuk le a Sanger-szekvenálási eredményeket A Sanger-szekvenálási eredmények megfelelő leolvasása attól függ, hogy a két komplementer DNS-szál közül melyik az érdekes, és milyen primer áll rendelkezésre. Ha a két DNS-szál A és B, és az A szál az érdekes, de a primer jobb a B szálhoz, akkor a kimeneti fragmentumok az A száléval lesznek azonosak. Másrészt, ha az A szál az érdekes, és a primer jobb az A szálhoz, akkor a kimeneti fragmentumok a B száléval lesznek azonosak. Ennek megfelelően a kimenetet vissza kell konvertálni az A szálra. Ha tehát az érdekes szekvencia "TACG", és a primer erre a szálra a legjobb, akkor a kimenet "ATGC" lesz, és ezért vissza kell konvertálni "TACG"-re. Ha azonban a primer a komplementer szálhoz ("ATGC") jobb, akkor a kimenet "TACG" lesz, ami a helyes szekvencia. Röviden, mielőtt elkezdenénk, tudnunk kell, hogy mit akarunk elérni, és hogyan fogunk oda eljutni! Tehát ezt szem előtt tartva, íme egy példa az előbbi példára (TACG -> ATGC -> TACG). Ha a dideoxinukleotidok jelölése T = sárga, A = rózsaszín, C = sötétkék és G = világoskék, akkor a primer-A, primer-AT, primer-ATG és primer-ATGC rövid szekvenciákat kapja. Miután a fragmentumokat elektroforézissel szétválasztottuk, a lézer a fragmentumokat hosszuk sorrendjében (rózsaszín, sárga, világoskék és sötétkék) fogja leolvasni, és kromatogramot készít. A számítógép átalakítja a betűket, így a végső szekvencia a helyes TACG lesz. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Sanger szekvenálás vs. PCR A Sanger-szekvenálás és a PCR hasonló kiindulási anyagokat használ, és együtt is használhatók, de egyik sem helyettesítheti a másikat. A PCR-t a DNS teljes egészében történő felerősítésére használják. Bár véletlenül különböző hosszúságú fragmentumok keletkezhetnek (pl. a DNS-polimeráz leeshet), a cél a teljes DNS-szekvencia megkettőzése. Ennek érdekében a "hozzávalók" a cél-DNS, a nukleotidok, a DNS-primer és a DNS-polimeráz (különösen a Taq-polimeráz, amely képes túlélni a PCR-hez szükséges magas hőmérsékletet). A Sanger-szekvenálás célja ezzel szemben a DNS minden lehetséges hosszának előállítása a cél-DNS teljes hosszáig. Ezért van szükség a PCR kiindulási anyagai mellett a dideoxinukleotidokra is. A Sanger-szekvenálás és a PCR összehozható a Sanger-szekvenálási protokoll kiindulási anyagának előállítása során. A PCR segítségével a szekvenálandó DNS több példányát lehet létrehozni. Azzal, hogy több mint egy templátból dolgozhatunk, hatékonyabbá válik a Sanger-protokoll. Ha a célszekvencia 1000 nukleotid hosszú, és a sablonból csak egy példány van, akkor az 1000 jelölt fragmentum előállítása hosszabb időt vesz igénybe. Ha azonban a templátnak több példánya van, elméletileg kevesebb időbe telik mind az 1000 jelölt fragmentum előállítása. ## Kapcsolódó termékek Sajnáljuk, váratlan hiba lépett fel Response not successful: Received status code 500 __Kapcsolódó cikkek__ - [Validating CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/validating-crispr-cas9-mediated-gene-editing) - [Ultrapure vs. DEPC Treated Water for Molecular Biology Applications](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/dna-and-rna-purification/nuclease-free-water) - [Water for Next-Generation Sequencing](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/next-gen-sequencing/water-for-next-generation-sequencing) - [Amino Acid Codon Wheel](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/amino-acid-codon-wheel) - [MULTI-seq Sample Multiplexing for Single Cell Analysis and Sequencing](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/multi-seq-sample-multiplexing-single-cell-analysis-sequencing) - [Sequencing Primers](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/sequencing-primers) - [Ultrapure Water for DNA Sequencing](https://www.sigmaaldrich.com/HU/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/water-dna-sequencing) __Kapcsolódó termékkategóriák__ - [Genetikai szűrés](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/genetic-screening) - [Génszerkesztés és funkcionális genomika](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics) - [CRISPR Cas9 fehérjék és génszerkesztés](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/crispr-gene-editing) - [RNAi Egyetlen klónok](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/rnai-single-clones) - [RNAi könyvtárak](https://www.sigmaaldrich.com/HU/hu/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/rnai-libraries) Felső __A folytatáshoz jelentkezzen be__ Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot. Bejelentkezés__Még nem rendelkezik fiókkal?__Regisztráció Ügyfeleink kényelme érdekében ezt az oldalt géppel fordítottuk le. Törekedtünk arra, hogy ez a fordítás pontos legyen. A gépi fordítás azonban nem tökéletes. Ha nem elégedett a gépi fordítással, kérjük, tekintse meg az angol nyelvű változatot. An unknown error has occured.