Sanger szekvenálás lépései és módszere
Mi a Sanger-szekvenálás?
A Sanger-szekvenálás, más néven "láncvégződési módszer" a DNS nukleotidszekvenciájának meghatározására szolgáló módszer. A módszert a kétszeres Nobel-díjas Frederick Sanger és munkatársai fejlesztették ki 1977-ben, innen ered a Sanger-szekvencia elnevezés.
A DNS általános szerkezetének áttekintéséhez lásd 2. ábra.
Hogyan működik a Sanger-szekvenálás?
A Sanger-szekvenálás végezhető manuálisan vagy, ami még gyakoribb, automatizált módon, szekvenálógépen keresztül (1. ábra). Mindegyik módszer három alapvető lépést követ, amelyeket az alábbiakban ismertetünk.
1. ábra.Az automatizált Sanger-szekvenálás három alapvető lépése.
Sanger szekvenálás lépései
A Sanger szekvenálásnak három fő lépése van.
1. DNS-szekvencia a láncvégződéses PCR-hez
Az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvenciát sablonként használják egy speciális típusú PCR úgynevezett láncvégződéses PCR. A láncvégződéses PCR ugyanúgy működik, mint a standard PCR, de egy lényeges különbséggel: módosított nukleotidok (dNTP-k), úgynevezett dideoxiribonukleotidok (ddNTP-k) hozzáadásával. A standard PCR hosszabbítási lépése során a DNS-polimeráz dNTP-ket ad a növekvő DNS-szálhoz azáltal, hogy foszfodiészterkötés kialakulását katalizálja az utolsó nukleotid szabad 3'-OH csoportja és a következő 5'-foszfátja között (2. ábra).
A láncvégződéses PCR-ben a felhasználó a PCR-reakcióban a normál dNTP-khez kis arányban kever láncvégződéses ddNTP-ket. A ddNTP-kből hiányzik a foszfodiészterkötés kialakításához szükséges 3'-OH csoport; ezért amikor a DNS-polimeráz véletlenszerűen beépít egy ddNTP-t, a hosszabbítás megszűnik. A láncvégződéses PCR eredménye az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia több millió-milliárd oligonukleotid-kópiája, amelyet 5'-ddNTP-kkel véletlenszerű hosszban (n) fejeznek be.
In manuális Sanger-szekvenálás során négy PCR-reakciót állítanak be, amelyek mindegyikébe csak egyféle ddNTP-t (ddATP, ddTTP, ddGTP és ddCTP) kevernek.
Az automatizált Sanger-szekvenálásban az összes ddNTP-t egyetlen reakcióban keverik össze, és a négy dNTP mindegyike egyedi fluoreszcens jelöléssel rendelkezik.
2. Méret szerinti szétválasztás gélelektroforézissel
A második lépésben a láncvégződésű oligonukleotidokat gélelektroforézissel méret szerint választjuk szét. A gélelektroforézis során a DNS-mintákat egy gélmátrix egyik végébe töltik, és elektromos áramot alkalmaznak; a DNS negatív töltésű, így az oligonukleotidok a gél ellentétes oldalán lévő pozitív elektróda felé húzódnak. Mivel minden DNS-darab tömegegységenként azonos töltéssel rendelkezik, az oligonukleotidok mozgásának sebességét csak a méret határozza meg. Minél kisebb egy fragmentum, annál kisebb súrlódás éri, amikor a gélen keresztül mozog, és annál gyorsabban fog mozogni. Ennek eredményeképpen az oligonukleotidok a legkisebbtől a legnagyobb felé haladva, a gélt alulról felfelé olvasva helyezkednek el.
A manuális Sanger-szekvenálás során a négy PCR-reakcióból származó oligonukleotidokat a gél négy külön sávjában futtatjuk. Ez lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy tudja, hogy melyik oligonukleotidok melyik ddNTP-nek felelnek meg.
A automatizált Sanger-szekvenálásban az összes oligonukleotidot egyetlen kapilláris gélelektroforézisben futtatják a szekvenálógépen belül.
3. Gélelemzés & A DNS-szekvencia meghatározása
Az utolsó lépés egyszerűen a gél leolvasása a bemeneti DNS szekvenciájának meghatározásához. Mivel a DNS-polimeráz csak 5' és 3' irányban szintetizálja a DNS-t egy megadott primerrel kezdve, minden egyes terminális ddNTP egy adott nukleotidnak felel meg az eredeti szekvenciában (pl, a legrövidebb fragmentumnak az 5' végétől számított első nukleotidnál kell végződnie, a második legrövidebb fragmentumnak az 5' végétől számított második nukleotidnál kell végződnie stb.) Ezért a gélsávok legkisebbtől a legnagyobbig történő leolvasásával meghatározhatjuk az eredeti DNS-szál 5' és 3' közötti szekvenciáját.
In manuális Sanger-szekvenálás során a felhasználó a gél mind a négy sávját egyszerre olvassa le, alulról felfelé haladva, és a sávok segítségével határozza meg a terminális ddNTP azonosságát az egyes sávokhoz. Ha például az alsó sávot a ddGTP-nek megfelelő oszlopban találjuk, akkor a legkisebb PCR-fragment ddGTP-vel végződik, és az eredeti szekvencia 5' végétől számított első nukleotid guanin (G) bázisú.
Az automatizált Sanger-szekvenálásban a számítógép a kapilláris gél minden egyes sávját sorrendben leolvassa, és a fluoreszcencia segítségével minden egyes terminális ddNTP azonosságát megadja. Röviden, egy lézer gerjeszti a fluoreszcens címkéket az egyes sávokban, és a számítógép érzékeli az így kibocsátott fényt. Mivel a négy ddNTP mindegyike más-más fluoreszcens jelöléssel van ellátva, a kibocsátott fény közvetlenül a terminális ddNTP azonosságához köthető. A kimenetet kromatogramnak nevezzük, amely az egyes nukleotidok fluoreszcens csúcsát mutatja a sablon DNS hossza mentén.
2. ábra.A DNS szerkezetének vázlata. A DNS egy molekula, amely két szálból áll, amelyek egymás köré tekeredve kettős spirált alkotnak. Mindkét szál dezoxiribonukleotidoknak (dNTP-k) nevezett molekulákból áll.
Minden dNTP tartalmaz egy foszfátcsoportot, egy cukorcsoportot és a négy nitrogénbázis [adenin (A), timin (T), guanin (G) vagy citozin (C)] egyikét. A dNTP-ket az egyik dNTP cukorcsoportja és a következő dNTP foszfátcsoportja közötti foszfodiészter kovalens kötések fűzik egymáshoz lineárisan; ez az ismétlődő cukor-foszfát minta alkotja a cukor-foszfát gerincet.
A két különálló szál nitrogénbázisai a komplementer bázisok közötti hidrogénkötésekkel kapcsolódnak egymáshoz, így alakul ki a kettős szálú DNS-helix.
Hogyan olvassuk le a Sanger-szekvenálási eredményeket
A Sanger-szekvenálási eredmények megfelelő leolvasása attól függ, hogy a két komplementer DNS-szál közül melyik az érdekes, és milyen primer áll rendelkezésre. Ha a két DNS-szál A és B, és az A szál az érdekes, de a primer jobb a B szálhoz, akkor a kimeneti fragmentumok az A száléval lesznek azonosak. Másrészt, ha az A szál az érdekes, és a primer jobb az A szálhoz, akkor a kimeneti fragmentumok a B száléval lesznek azonosak. Ennek megfelelően a kimenetet vissza kell konvertálni az A szálra.
Ha tehát az érdekes szekvencia "TACG", és a primer erre a szálra a legjobb, akkor a kimenet "ATGC" lesz, és ezért vissza kell konvertálni "TACG"-re. Ha azonban a primer a komplementer szálhoz ("ATGC") jobb, akkor a kimenet "TACG" lesz, ami a helyes szekvencia.
Röviden, mielőtt elkezdenénk, tudnunk kell, hogy mit akarunk elérni, és hogyan fogunk oda eljutni! Tehát ezt szem előtt tartva, íme egy példa az előbbi példára (TACG -> ATGC -> TACG). Ha a dideoxinukleotidok jelölése T = sárga, A = rózsaszín, C = sötétkék és G = világoskék, akkor a primer-A, primer-AT, primer-ATG és primer-ATGC rövid szekvenciákat kapja. Miután a fragmentumokat elektroforézissel szétválasztottuk, a lézer a fragmentumokat hosszuk sorrendjében (rózsaszín, sárga, világoskék és sötétkék) fogja leolvasni, és kromatogramot készít. A számítógép átalakítja a betűket, így a végső szekvencia a helyes TACG lesz.
Sanger szekvenálás vs. PCR
A Sanger-szekvenálás és a PCR hasonló kiindulási anyagokat használ, és együtt is használhatók, de egyik sem helyettesítheti a másikat.
A PCR-t a DNS teljes egészében történő felerősítésére használják. Bár véletlenül különböző hosszúságú fragmentumok keletkezhetnek (pl. a DNS-polimeráz leeshet), a cél a teljes DNS-szekvencia megkettőzése. Ennek érdekében a "hozzávalók" a cél-DNS, a nukleotidok, a DNS-primer és a DNS-polimeráz (különösen a Taq-polimeráz, amely képes túlélni a PCR-hez szükséges magas hőmérsékletet).
A Sanger-szekvenálás célja ezzel szemben a DNS minden lehetséges hosszának előállítása a cél-DNS teljes hosszáig. Ezért van szükség a PCR kiindulási anyagai mellett a dideoxinukleotidokra is.
A Sanger-szekvenálás és a PCR összehozható a Sanger-szekvenálási protokoll kiindulási anyagának előállítása során. A PCR segítségével a szekvenálandó DNS több példányát lehet létrehozni.
Azzal, hogy több mint egy templátból dolgozhatunk, hatékonyabbá válik a Sanger-protokoll. Ha a célszekvencia 1000 nukleotid hosszú, és a sablonból csak egy példány van, akkor az 1000 jelölt fragmentum előállítása hosszabb időt vesz igénybe. Ha azonban a templátnak több példánya van, elméletileg kevesebb időbe telik mind az 1000 jelölt fragmentum előállítása.
Kapcsolódó termékek
Response not successful: Received status code 500
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?Ügyfeleink kényelme érdekében ezt az oldalt géppel fordítottuk le. Törekedtünk arra, hogy ez a fordítás pontos legyen. A gépi fordítás azonban nem tökéletes. Ha nem elégedett a gépi fordítással, kérjük, tekintse meg az angol nyelvű változatot.