Protocollo PCR standard

Come fare la PCR

Un'impostazione standard della reazione a catena della polimerasi (PCR) consiste in quattro passaggi:

1. Aggiungi i reagenti richiesti o la mastermix e il templato alle provette per PCR.
2. Miscela e centrifuga.
3. Amplificare secondo i parametri del termociclatore e dei primer.
4. Valutare il DNA amplificato mediante elettroforesi su gel di agarosio seguita da colorazione con bromuro di etidio.

Queste fasi sono presentate di seguito in modo più dettagliato, insieme a suggerimenti per la scelta dei materiali e dei reagenti. Questo è un protocollo di PCR di base che utilizza la Taq DNA polimerasi.

Fasi della PCR e componenti essenziali della PCR

La risoluzione dei problemi di una reazione di PCR coinvolge molti fattori. Guardate questa animazione per scoprire come la selezione dei componenti e delle condizioni di ciclaggio giuste per le vostre esigenze possa aiutarvi a ottenere risultati ottimali.

Trovate altri protocolli per altre polimerasi o tecniche di PCR avanzate nella sezione Protocolli della nostra Guida alle tecnologie PCR.

Per saperne di più sulla PCR standard, compresa la sua natura, consultare la nostra pagina Pagina di base della PCR.

Reagenti: Cosa serve per la PCR?

Reagente usato nella PCR	Prodotto raccomandato <
Taq DNA polimerasi	Selezionare Taq DNA polimerasi in base alle preferenze dell'utente. (Vedere la tabella separata Taq polimerasi di seguito.)
Acqua di gradoPCR	Acqua per reagentiPCR
Primers diluiti alla concentrazione di lavoro	Scorte di lavoro da 10 µM sono sufficienti per la maggior parte dei saggi.
Oligo	Oligo personalizzati
DNA da amplificare	Fornito dal ricercatore
Pipette dedicate
Ciclatore termico	Con blocchi di pozzetti di varie dimensioni o in multiformato
Punte per pipette filtranti sterili
Puntali per pipette sterili da 1.Provette per microcentrifuga da 5 mL con tappo a vite	Corning® provette per microcentrifuga con tappo a vite<
Provette o piastre per PCR	Scegliere in base al ciclatore:
	Singole provette per PCR da 200 µL a parete sottile
	provette strip da 200 µL
	Piastre multiwell e sigillo della piastra
dNTP mix	Deoxynucleotide mix contenente 10 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP *le miscele già includono i dNTP

Che cos'è Taq Polimerasi?

Taq DNA polimerasi è un enzima termostabile derivato dal batterio termofilo Thermus aquaticus. È  comunemente usato per amplificare frammenti di DNA nella PCR. L'enzima è in forma ricombinante, espresso in E. coli. È in grado di resistere a ripetuti riscaldamenti a 95 °C (come richiesto dalla tecnica della PCR) senza una significativa perdita di attività. L'enzima ha un peso molecolare di circa 94 kDa all'SDS-PAGE, senza attività endonucleasica o esonucleasica rilevabile. Possiede attività di 5'→3' DNA polimerasi e 5'→3' esonucleasi. Ogni lotto di Taq DNA polimerasi è testato per l'amplificazione PCR e il sequenziamento a doppio filamento. L'enzima è fornito a 5 unità/µL e viene fornito con un tampone di reazione 10x ottimizzato.

Standard Taq DNA polimerasi

Utilizzare la tabella sottostante per selezionare una miscela appropriata di Taq DNA polimerasi per le condizioni di reazione. Scegliere tra formulazioni trasparenti o colorate di rosso con e senza cloruro di magnesio (MgCl₂) o una miscela pronta o una master mix preconfezionata con tampone e dNTP.

Contenente MgCl2		Separato MgCl2	Readymix
Formulazione trasparente senza colorante	Con colorante rosso per il caricamento diretto su gel	Formulazione trasparente senza colorante<		Con colorante rosso per carico diretto su gel	Formulazione trasparente senza colorante
Taq DNA polimerasi da Thermus aquaticus (D1806)	REDTaq® DNA Polymerase (D4309)	Taq DNA Polimerasi da Thermus aquaticus, senza MgCl2 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ Miscela di reazione PCR (R2523)	ReadyMix™ Taq Miscela di reazione PCR (P4600)

Definizione dell'unità: Un'unità incorpora 10 nmol di deossiribonucleosidi trifosfati totali in DNA precipitabile in acido in 30 minuti a 74 °C.

Procedura: Fasi della PCR

Le condizioni ottimali per la concentrazione di Taq DNA polimerasi, DNA modello, primer e MgCl₂ dipendono dal sistema utilizzato. Potrebbe essere necessario determinare le condizioni ottimali per ogni singolo componente. Questo vale soprattutto per la Taq DNA polimerasi, i parametri di ciclaggio e la concentrazione di MgCl₂. Si consiglia di titolare l'enzima e la concentrazione di MgCl₂ per determinare l'efficienza ottimale.

1. Aggiungere i reagenti in una provetta di dimensioni adeguate nell'ordine indicato nella tabella. (Selezionare la tabella appropriata per l'impostazione della reazione: reagente standard o readymix). Per un numero elevato di reazioni, è necessario preparare una mastermix senza il templato e aliquotarla nelle provette di reazione. Alla fine, il templato deve essere aggiunto alle provette appropriate.
   

Reazione PCR standard

Modalità	Componente	Concentrazione finale
w µL	Acqua
5 µL	10x PCR Buffer (P2192 o P2317)*	1x
1 µL	Miscela di deossinucleotidi	200 µM
w µL	Forward primer (tipicamente 15-30 basi di lunghezza)	0.1-0.5 µM
x µL	Primer inverso (tipicamente lungo 15-30 basi)	0.1-0,5 µM
0.5 µL	Taq DNA Polimerasi*	0.05 unità/µL
y µL	Template DNA (tipicamente 10 ng)	200 pg/µL
z µL	25 mM di MgCl2(usare solo con il tampone P2317)	0.1-0.5 mM
50 µL	Volume totale di reazione

*Acquistare buffer e Taq polimerasi insieme: D1806, D4309 o D4545

Readymix Reazione PCR

Montaggio	Componente	Concentrazione finale
25 µL	Readymix (R2523 oppure P4600)
w µL	Forward primer (tipicamente 15-30 basi di lunghezza)	0.1-0.5 µM
x µL	Primer inverso (tipicamente 15-30 basi di lunghezza)	0.1-0.5 µM
y µL	Template DNA (in genere 10 ng)	200 pg/µL
z µL	200 pg/µL	Acqua
50 µL	Volume totale di reazione

2. Mescolare delicatamente con un vortex e centrifugare brevemente per raccogliere tutti i componenti sul fondo della provetta.

Nota: aggiungere 50 µL di olio minerale alla sommità di ogni provetta per evitare l'evaporazione se si utilizza un termociclatore senza coperchio riscaldato.

3. Amplificare. I parametri di amplificazione variano a seconda dei primer e del termociclatore utilizzato. Potrebbe essere necessario ottimizzare il sistema per i singoli primer, il template e il termociclatore.

Parametri ciclici tipici

Si raccomandano 25-30 cicli di amplificazione.

FasePCR	Temperatura °C	Durata
Modello di denaturazione	94 °C	1 min
Anneal dei primer	55 °C	2 min
Estensione	72 °C	3 min

4. Il DNA amplificato può essere valutato mediante elettroforesi su gel di agarosio e successiva colorazione con bromuro di etidio.

        Nota: la sovrapposizione di olio minerale può essere rimossa con una singola estrazione con cloroformio (1:1), recuperando la fase acquosa.

Reagenti per l'elettroforesi dell'acido nucleico

• Agarosio  (gel prefabbricati, polvere, ecc.)
• Buffer come MOPS-EDTA-acetato di sodio, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
• Soluzione di caricamento del gel e tampone di caricamento del campione di RNA
• Macchia o colorante per elettroforesi come il bromuro di etidio

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