Znakowanie peptydami

Przegląd sekcji

• Chromogen Labeling
• Żywice NovaTag™
• .Aminometylokumaryna (AMC)
• 7-metoksykumaryna (MCA)
• Dabcyl

 

• 2,4-Dinitrophenyl (DNP)
• EDANS
• DANSYL
• FAM/TAMRA.
• Powiązane produkty

Peptydy znakowane fluorescencyjnie i biotyną są nieocenionymi narzędziami w biochemii, mającymi liczne zastosowania w enzymologii, chemii białek, immunologii i histochemii. Oferujemy szeroką gamę odczynników znakujących do syntezy takich peptydów, w tym unikalne żywice NovaTag™ do produkcji peptydów znakowanych C-terminalnie.

Chromogen labeling

Właściwości spektralne żywic Novabiochem^® pochodne chromogenne i fluorogenne podsumowano w Tabeli 1.

Tabela 1.Właściwości spektralne barwników.

Chromofor/Fluorofor	λmax (nm)	λem (nm)	Quencher
AMC	342	441	-
Dabcyl	453	-	-
Dansyl	335	526	Dabsyl
Dnp	348	-	-
EDANS	341	471	Dabcyl
Mca	328	393	Dnp
FAM	494	518	Dabcyl
TAMRA	555	580	-

Jednym z najważniejszych zastosowań takich odczynników jest synteza substratów enzymatycznych wygaszanych fluorescencyjnie. Są to bardzo czułe narzędzia do badania specyficzności i aktywności proteaz, szczególnie w przypadku endoproteaz, gdzie konwencjonalne substraty znakowane karboksyterminalnie nie zawsze są odpowiednie. Takie substraty zazwyczaj zawierają fluorofor i grupę wygaszającą przyłączone po obu stronach miejsca rozszczepienia. W nienaruszonej cząsteczce naturalna fluorescencja fluoroforu jest tłumiona przez bliskość wygaszacza w procesie zwanym transferem energii rezonansu fluorescencji (FRET). Po rozszczepieniu substratu przez proteazę, wygaszacz i fluorofor zostają rozdzielone, co prowadzi do wzrostu fluorescencji, którą można następnie wykryć spektrofotometrycznie (Rysunek 1). Czułość zależy przede wszystkim od odległości między fluoroforem a wygaszaczem, która powinna mieścić się w zakresie 10-100 Å, oraz od stopnia nakładania się widma absorbancji wygaszacza i widma emisji fluoroforu. Zalecane pary fluorofor-wygaszacz są wymienione w Tabeli 1.

Rysunek 1. Substrat peptydowy wygaszany fluorescencyjnie

Żywice NovaTag™

Znaki są najczęściej umieszczane na N-końcu peptydu podczas syntezy w fazie stałej, ponieważ jest to bardzo proste z punktu widzenia syntezy przy użyciu pochodnych kwasu karboksylowego, takich jak biotyna-OSu, TAMRA itp. W przypadku wielu zastosowań korzystne jest jednak umieszczenie etykiety na C-końcu, szczególnie jeśli N-koniec jest wymagany do aktywności biologicznej lub jeśli peptyd zawiera więcej niż jedną etykietę.

Co więcej, w przypadku substratów enzymatycznych opartych na FRET, często preferowane jest umieszczenie pary fluorofor/quencher na N- i C-końcu, a nie na łańcuchach bocznych aminokwasów, ponieważ pozwala to uniknąć modyfikacji natywnej sekwencji peptydu.

Rysunek 2. Żywice NovaTag

Żywice NovaTag™ są unikalnymi narzędziami zaprojektowanymi w celu usprawnienia Fmoc SPPS peptydów znakowanych chromogenem i biotyną^1-3. Każda żywica zawiera standardowy, usuwalny TFA łącznik, który został zmodyfikowany tak, aby zawierał przekładkę diaminową, która jest chroniona ortogonalnie lub wstępnie derywatyzowana za pomocą chromogennej etykiety (Rysunek 2). Taki układ pozwala na szybkie i wydajne przygotowanie peptydów znakowanych C-końcowo przy minimalnej liczbie etapów syntezy.

Dostępne są wstępnie załadowane żywice, które po rozszczepieniu bezpośrednio dostarczają peptydy zawierające fluorofory (Dansyl, Mca, EDANS) i grupy wygaszające (Dnp) do zastosowań FRET lub etykiety powinowactwa (biotyna, biotyna-PEG, hydroksyloamina) do biokoniugacji i immobilizacji powierzchniowej. Wstępnie załadowane żywice są łatwe w użyciu i mogą być ogólnie stosowane w zautomatyzowanym oprzyrządowaniu bez modyfikacji istniejących protokołów syntezy Fmoc. Jedynymi wyjątkami są żywice EDANS NovaTag™ i Universal NovaTag™, w których przyłączenie pierwszej reszty musi być przeprowadzone w zmodyfikowanych warunkach, ponieważ wiąże się to z acylowaniem drugorzędowej aminy (Metoda 2). Po wydłużeniu łańcucha i rozszczepieniu za pomocą TFA w zwykły sposób, uzyskuje się produkty zawierające odpowiedni fluorofor lub biotynę na C-końcu.

Użycie wstępnie załadowanych żywic pozwala uniknąć nieodłącznych problemów związanych ze słabą rozpuszczalnością i nieefektywnym sprzęganiem, a także dodatkowych etapów i kosztów, które są związane z wprowadzeniem biotyny i niektórych fluoroforów w syntezie w fazie stałej. Podejście to jest szczególnie odpowiednie do produkcji peptydów do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, ponieważ eliminuje trudności związane z zapewnieniem całkowitego włączenia etykiety dla wszystkich cząsteczek w macierzy. Żywice NovaTag™ zawierające różne etykiety i grupy dystansowe mogą być również wytwarzane na zamówienie.

Po załadowaniu (Metoda 2) pierwszego aminokwasu do związanej z żywicą aminy drugorzędowej, przedłużenie łańcucha przeprowadza się standardowymi metodami Fmoc. Po syntezie żywica może zostać podzielona, a każda podwielokrotność zakończona odpowiednią etykietą funkcjonalizowaną karboksylowo. Zawieszona grupa Mmt jest następnie usuwana przy użyciu HOBt/TFE/DCM (metoda 1), a C-końcowa etykieta jest wprowadzana do każdej podwielokrotności żywicy. W ten sposób z pojedynczej syntezy można przygotować dowolną liczbę wariantów etykiet dla danej sekwencji.

Metoda 1: Usuwanie grupy Mmt

1. Dodaj 0.6 M HOBt w DCM/TFE (1:1) do żywicy spęcznionej w DCM.
2. Delikatnie mieszać przez 1 godzinę; roztwór staje się ciemnoczerwony.
3. Rozpuszczalnik jest usuwany przez filtrację, a kroki 1 i 2 są powtarzane.
4. Żywica jest usuwana przez filtrację, przemywana DMF i używana natychmiast w syntezie lub przemywana dalej DCM, a następnie MeOH, suszona i przechowywana do późniejszego użycia.

Aminometylokumaryna (AMC)

Substraty enzymatyczne oparte na fluoroforze 7-amino-4-metylokumaryny (AMC) są bardzo popularnymi narzędziami do badania aktywności i specyficzności proteaz⁸. W takich substratach AMC jest zazwyczaj połączony z peptydem poprzez utworzenie wiązania amidowego między aminą kumarynową a grupą karboksylową C-końcowej reszty aminokwasowej (Rysunek 3). Proteoliza tego wiązania amidowego uwalnia wolny AMC, powodując duży wzrost fluorescencji, który można wykryć przy 441 nm po wzbudzeniu przy 342 nm.

Rysunek 3. Zasada działania substratów fluorogenicznych znakowanych AMC.

Synteza pochodnych peptyd-AMC jest szczególnie problematyczna ze względu na słabą nukleofilowość grupy aminowej AMC. Zwykła strategia obejmuje najpierw utworzenie pochodnej AMC C-końcowej reszty aminokwasowej, a następnie kondensację fragmentu lub stopniowe wydłużanie. Podejście to nie jest oczywiście odpowiednie dla metod w fazie stałej i nie może być stosowane do produkcji bibliotek substratów enzymatycznych do profilowania proteaz. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wprowadziliśmy wstępnie załadowane pochodne aminokwasów-AMC: Fmoc-Asp(żywica Wanga)-AMC; Fmoc-Lys(karbaminian żywicy Wanga)-AMC. Kwas asparaginowy i lizyna zostały wybrane, ponieważ aminokwasy te występują w pozycji P1 endogennych substratów dla kilku ważnych proteaz.

Fmoc-Asp(żywica Wang)-AMC (8.56146)

Fmoc-Lys(żywica karbaminianowa Wang)-AMC (8.56147)

Żywice te są niezwykle proste w użyciu i w pełni kompatybilne ze standardowymi protokołami Fmoc SPPS. Wolna grupa aminowa może być acylowana aminokwasami Fmoc aktywowanymi za pomocą PyBOP^® lub TBTU. Po złożeniu peptydu, rozszczepienie 95% TFA uwalnia peptyd-AMC bezpośrednio ze stałego nośnika bez żadnych dodatkowych etapów.

Rysunek 4. Synteza Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC przy użyciu Fmoc-Asp(żywica Wang)-AMC

7-metoksykumaryna (Mca)

Grupa 7-metoksykumaryny (Mca) fluoryzuje przy 393 nm, gdy jest stymulowana przy 328 nm, i jest najczęściej stosowana w połączeniu z grupami wygaszającymi 2,4-dinitrofenylu (Dnp)⁹. Może być sprzężony w fazie stałej z wolnymi aminami przy użyciu Mca-OSu, Mca-OHlub włączony podczas przedłużania łańcucha przy użyciu wstępnie uformowanego bloku budulcowego, takiego jak Fmoc-Lys(Mca)-OH¹⁰. Fmoc-Lys(Mca)-OH i Mca-OH mogą być sprzęgane przy użyciu dowolnej standardowej metody sprzęgania, takiej jak PyBOP^®/DIPEA i DIPCDI/HOBt, podczas gdy wstępnie aktywowana pochodna, Mca-OSu, sprzęga się najlepiej w DMSO lub NMP w obecności HOBt. Grupa kumarynowa jest stabilna w standardowych warunkach stosowanych w Fmoc SPPS.

Fmoc-Lys(Mca)-OH (8.52095)

Mca-OH (8.51071)

Żywica Mca NovaTag™ (8.55052)

Żywica Mca NovaTag™ dostarcza peptydy C-końcowo zmodyfikowane fluoroforem Mca przyłączonym poprzez przekładkę etylenodiaminy^1-3. Po usunięciu grupy Fmoc, związaną z żywicą aminę pierwszorzędową można obciążyć pierwszą resztą aminokwasową przy użyciu standardowych metod aktywacji, takich jak PyBOP, HOBt/DIPCDI. Po złożeniu peptydu, traktowanie 95% TFA rozszczepia peptyd Mca bezpośrednio z żywicy.

Dabcyl

Fmoc-Lys(Dabcyl)-OH (8.52096)

 

Dabcyl jest jedną z najczęściej stosowanych grup wygaszających ze względu na brak wrodzonej fluorescencji i nakładanie się widm (λ_max 453 nm) z wieloma powszechnie stosowanymi fluoroforami, takimi jak EDANS, Mca, TET, JOE, FAM. W przygotowaniu substratów peptydowych wygaszanych fluorescencyjnie, jest on najczęściej stosowany w połączeniu z EDANS, ponieważ to połączenie jest szczególnie skuteczne ze względu na ich doskonałe nakładanie się widmowe^11,12.

Grupę Dabcyl najwygodniej jest wprowadzić podczas syntezy substratu w fazie stałej. Dodanie do N-końcowej grupy aminowej najlepiej osiągnąć stosując Dabcyl-OSu w DMSO lub NMP w obecności HOBt. Gdy grupa Dabcyl ma być zlokalizowana w łańcuchu peptydowym, najprostszym podejściem jest wprowadzenie Lys(Dabcyl) w pożądanej pozycji przy użyciu Fmoc-Lys(Dabcyl)-OH aktywowanego PyBOP^®/DIPEA.

Dabcyl-OSu (8.51022)

2,4-dinitrofenyl (Dnp)

Fmoc-Lys(Dnp)-OH
(8.52099)

 

Grupa Dnp (λ_max 348 nm) jest preferowaną grupą wygaszającą dla fluoroforu Mca⁹. Najłatwiej jest ją włączyć do peptydu jako Fmoc-Lys(Dnp)-OH, który może być sprzężony przy użyciu dowolnej standardowej metody aktywacji.

EDANS

Para fluorofor-wygaszacz EDANS/Dabcyl jest jedną z najczęściej stosowanych w aplikacjach FRET, dzięki doskonałemu nakładaniu się widma emisji EDANS (λex 341 nm) i widma absorbancji Dabcyl (λem 471 nm)._ex 341 nm, λ_em 471 nm) i widmem absorbancji Dabcyl (λ_max 453 nm)^9,10  (Rys. 5). Wygaszanie fluorescencji EDANS przez Dabcyl jest w konsekwencji wysoce wydajne, z nawet 40-krotnym wzrostem fluorescencji zaobserwowanym po proteolizie peptydów znakowanych Dabcylem/EDANS¹³.

Rysunek 5. Widma absorbancji i emisji dabcylu i EDANS

Aby włączyć EDANS do łańcucha peptydowego, najprostszym podejściem jest użycie Fmoc-Glu(EDANS)-OH podczas montażu peptydu^13,14. Wprowadzenie tych pochodnych podczas SPPS można osiągnąć stosując aktywację PyBOP^®/DIPEA w połączeniu z wydłużonym czasem sprzęgania¹⁴. Należy unikać silnych odczynników acylujących, takich jak PyBrOP, ponieważ ich użycie może prowadzić do acylowania azotu naftyloaminy.

Żywica EDANS NovaTag™

Rysunek 6. Załadowana żywica EDANS NovaTag™ pokazująca punkt przyłączenia peptydu i miejsce rozszczepienia.

Tradycyjnie, wprowadzenie ugrupowania EDANS na C-końcu peptydu uzyskuje się poprzez sprzężenie fragmentu peptydu z EDANS w roztworze¹⁵. Żywica EDANS NovaTag ™ firmy Novabiochem^® umożliwia po raz pierwszy bezpośrednią syntezę peptydów znakowanych EDANS na C-końcu peptydu metodą syntezy w fazie stałej²  (Rysunek 6). Ponieważ fluorofor EDANS jest wbudowany w łącznik, zostaje on połączony z C-końcem peptydu, gdy pierwszy aminokwas jest przyłączony do żywicy. Grupa wygaszająca Dabcyl może być wprowadzona do N-końca przy użyciu Dabcyl-OSu w DMSO lub DMF w obecności HOBt. Jeśli grupa Dabcyl ma być zlokalizowana w łańcuchu peptydowym, najprostszym podejściem jest wprowadzenie Lys(Dabcyl) w pożądanym miejscu przy użyciu Fmoc-Lys(Dabcyl)-OH  aktywowanego za pomocą PyBOP^®/DIPEA.

Pierwszym i najważniejszym krokiem w stosowaniu żywicy EDANS NovaTag™ jest przyłączenie pierwszej reszty aminokwasowej. Ponieważ proces ten obejmuje acylowanie związanej z żywicą aminy drugorzędowej, najlepiej przeprowadzić go przy użyciu aktywacji HATU (Metoda 2). Można również zastosować estry Pfp w obecności kolidyny, chociaż mogą być wymagane dłuższe czasy acylowania. Ważne jest, aby reakcja ta została przeprowadzona do końca, ponieważ wszelkie nieprzereagowane grupy aminowe pozostawione na żywicy mogą reagować w kolejnych sprzężeniach i prowadzić do tworzenia skróconych sekwencji. Po załadowaniu, substytucja żywicy powinna zostać sprawdzona za pomocą testu Fmoc UV, a jeśli to konieczne, reakcja ładowania powinna zostać powtórzona przy użyciu świeżych odczynników. Po załadowaniu pierwszego aminokwasu można przeprowadzić syntezę peptydu w standardowych warunkach. Należy unikać stosowania PyBroP^® ponieważ może to prowadzić do podwójnej acylacji. Rozszczepienie żywicy można przeprowadzić przy użyciu standardowych koktajli TFA; jednak ze względu na bliskość azotu naftyloaminy do miejsca rozszczepienia łącznika, uwalnianie produktu może być czasami powolne. Reakcję można przyspieszyć, jeśli to konieczne, dodając kilka kropli TMSBr do standardowego koktajlu TFA, pod warunkiem pominięcia wody.

Żywica EDANS NovaTag™ została ostatnio wykorzystana do przygotowania fluorescencyjnie znakowanych sond powinowactwa aminoalkanodifenylofosfonianu dla proteaz serynowych podobnych do chymotrypsyny i elastazy¹⁶.

Metoda 2: Ładowanie żywic EDANS/Universal/Biotin-PEG NovaTag™

1. Zawiesić żywicę w DMF i pozostawić do spęcznienia na 30 min. (W przypadku żywicy Universal/Biotin-PEG NovaTag™ grupa Fmoc powinna być usunięta na tym etapie za pomocą 20% piperydyny w DMF.)
2. Rozpuścić Fmoc-aminokwas (2,5 eq.) i HATU (2,5 eq.) w minimalnej objętości DMF i dodać do żywicy. Dodać DIPEA (5 eq.) i wymieszać.
3. Mieszaninę pozostawia się na 2 godziny z delikatnym mieszaniem. Próbkę żywicy można usunąć, a obciążenie określić za pomocą testu Fmoc UV [Metoda 11: Oszacowanie poziomu przyłączenia pierwszej reszty]. W razie potrzeby powtórzyć sprzęganie ze świeżymi odczynnikami.
4. Żywicę usuwa się przez filtrację, przemywa DMF i natychmiast wykorzystuje w syntezie lub przemywa dalej DCM, a następnie MeOH, suszy i przechowuje do późniejszego wykorzystania.

DANSYL

Żywica Dansyl NovaTag™ (8.515050)

Żywica ta ułatwia bezpośrednią syntezę peptydów C-końcowo znakowanych grupą dandylową (λ_ex 335 nm, λ_em 526 nm). Po usunięciu grupy Fmoc, związaną z żywicą aminę pierwszorzędową można obciążyć pierwszą resztą aminokwasową przy użyciu standardowych metod aktywacji, takich jak PyBOP^®, HOBt/DIPCDI. Po złożeniu peptydu, traktowanie 95% TFA rozszczepia peptyd Dansyl bezpośrednio z żywicy.

Żywica Dansyl NovaTag™ została wykorzystana do przygotowania sond FRET dla białka wiążącego rtęć MerP¹⁷ i sfunkcjonalizowanych fibryli amyloidowych¹⁸.

FAM/TAMRA

.

5-Karboksyfluoresceina (8.51025)

6-karboksyfluoresceina (8.51072)

Novabiochem^® dostarcza karboksyfluoresceinę (FAM; λ_ex 494 nm, λ_em 518 nm) i karboksytetrametylorodaminę (TAMRA, λ_ex 555 nm; λ_em 580 nm) jako pojedyncze izomery, zapewniając znakowane produkty o określonej strukturze chemicznej, a także znacznie ułatwiając oczyszczanie i charakteryzację produktu. Jednak dla tych zastosowań, które nie wymagają pojedynczego izomeru barwnika, 5,6-karboksyfluoresceina jest również dostępna jako opłacalna opcja.

5-Carboxytetramethylrhodamine (8.51025)

6-karboksytetrametylorodamina (8.51073)

Barwniki są najwygodniej wprowadzane podczas syntezy w fazie stałej poprzez sprzęganie z N-końcowymi lub bocznymi grupami aminowymi przy użyciu HOBt lub HOAt/DIPCDI w DMF (Metoda 3). Gdy jeden z barwników ma być umieszczony na bocznej grupie aminowej, najprostszym podejściem jest włączenie ortogonalnie chronionej pochodnej, takiej jak Lys(Mtt) lub Lys(ivDde), która może być później selektywnie deprotekowana na żywicy bezpośrednio przed sprzężeniem barwnika. Po dodaniu FAM i kolejnych aminokwasów, żywicę należy przemyć 20% piperydyną w DMF w celu usunięcia estrów fenylowych utworzonych przez acylowanie fenolowych hydroksyli FAM. Traktowanie peptydów FAM hydrazyną może prowadzić do tworzenia hydrazonu. Estrów i tworzenia hydrazonu można uniknąć, jeśli po wprowadzeniu FAM i późniejszej obróbce piperydyną, fenolowe hydroksyle zostaną zablokowane przez tritylowanie Trt-Cl i DIPEA w DCM². TAMRA i FAM mogą być również dodawane przy użyciu wstępnie uformowanych estrów OSu.

Gdy są stosowane razem w tym samym peptydzie, transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) między FAM i TAMRA powoduje wygaszenie fluorescencji obu barwników, co czyni je doskonałymi odczynnikami do zastosowań FRET¹⁹.

Metoda 3: Sprzęganie barwników funkcjonalizowanych karboksylowo

1. Rozpuścić barwnik (1.5 eq.) w minimalnej ilości DMF z HOBt lub HOAt (1.5 eq.). Jeśli to konieczne, dodać DMSO w celu ułatwienia rozpuszczania.
2. Dodać DIPCDI (1,7 eq.) i mieszać mieszaninę i odstawić na 10 min.
3. Dodać mieszaninę odsączonej żywicy peptydylowej i delikatnie mieszać przez 2 h. Sprawdzić wolne grupy aminowe za pomocą testu Kaisera. Uwaga: test TNBS nie działa w przypadku kulek zawierających kolorowe barwniki. Jeśli reakcja nie jest zakończona, pozostawić bezczynnie, a następnie ponownie sprawdzić. Jeśli po tym czasie reakcja nadal nie jest zakończona, przepłucz żywicę i powtórz ją ze świeżymi odczynnikami.

Pochodne chromogeniczne

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500

Referencje

1. Beythien J, White P. 2003 . A versatile linker strategy to C-terminally labeled peptides Biopolymers . 71 3.

2. Baumeister Bea. 2003 . Introduction of PEG units to improve solubility of biotinylated peptides Biopolymers . 71 3.

3. Beythien J, White PD. 2005. A solid phase linker strategy for the direct synthesis of EDANS-labelled peptide substrates. Tetrahedron Letters. 46(1):101-104. https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2004.11.026

4. Fischer R, Mader O, Jung G, Brock R. 2003. Extending the Applicability of Carboxyfluorescein in Solid-Phase Synthesis. Bioconjugate Chem.. 14(3):653-660. https://doi.org/10.1021/bc025658b

5. Gao Z, Tian Y, Wang J, Yin Q, Wu H, Li Y, Jiang X. 2007. A Dimeric Smac/Diablo Peptide Directly Relieves Caspase-3 Inhibition by XIAP. J. Biol. Chem.. 282(42):30718-30727. https://doi.org/10.1074/jbc.m705258200

6. Choi WJ, Kim S, Stephen AG, Weidlich I, Giubellino A, Liu F, Worthy KM, Bindu L, Fivash MJ, Nicklaus MC, et al. 2009. Identification of Shc Src Homology 2 Domain-Binding Peptoid?Peptide Hybrids. J. Med. Chem.. 52(6):1612-1618. https://doi.org/10.1021/jm800789h

7. Marceau P, Buré C, Delmas AF. 2005. Efficient synthesis of C-terminal modified peptide ketones for chemical ligations. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15(24):5442-5445. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2005.08.105

8. Maly, et al. DJ. 2002. Chembiochem. 316.

9. Knight C, Willenbrock F, Murphy G. 1992. A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases. 296(3):263-266. https://doi.org/10.1016/0014-5793(92)80300-6

10. Lauer-Fields JL, Broder T, Sritharan T, Chung L, Nagase H, Fields GB. 2001. Kinetic Analysis of Matrix Metalloproteinase Activity Using Fluorogenic Triple-Helical Substrates?. Biochemistry. 40(19):5795-5803. https://doi.org/10.1021/bi0101190

11. Wang GT, Matayoshi E, Jan Huffaker H, Krafft GA. 1990. Design and synthesis of new fluorogenic HIV protease substrates based on resonance energy transfer. Tetrahedron Letters. 31(45):6493-6496. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)97099-0

12. Matayoshi E, Wang G, Krafft G, Erickson J. 1990. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer. Science. 247(4945):954-958. https://doi.org/10.1126/science.2106161

13. Maggiora LL, Smith CW, Zhang ZY. 1992. A general method for the preparation of internally quenched fluorogenic protease substrates using solid-phase peptide synthesis. J. Med. Chem.. 35(21):3727-3730. https://doi.org/10.1021/jm00099a001

14. Kaumaya P, Hodges S. 1993 . Peptides: Chemistry, Structure & Biology: Proc. 14th . American Peptide Symposium Mayflower Scientific Ltd., ; England : p. 129.

15. Garcia-Echeverria C, Rich DH. 1992. New intramolecularly quenched fluorogenic peptide substrates for the study of the kinetic specificity of papain. 297(1-2):100-102. https://doi.org/10.1016/0014-5793(92)80336-f

16. Gilmore BF, Quinn DJ, Duff T, Cathcart GR, Scott CJ, Walker B. 2009. Expedited Solid-Phase Synthesis of Fluorescently Labeled and Biotinylated Aminoalkane Diphenyl Phosphonate Affinity Probes for Chymotrypsin- and Elastase-Like Serine Proteases. Bioconjugate Chem.. 20(11):2098-2105. https://doi.org/10.1021/bc9002162

17. White BR, Liljestrand HM, Holcombe JA. A ?turn-on? FRET peptide sensor based on the mercury bindingprotein MerP. Analyst. 133(1):65-70. https://doi.org/10.1039/b711777a

18. Gras SL, Tickler AK, Squires AM, Devlin GL, Horton MA, Dobson CM, MacPhee CE. 2008. Functionalised amyloid fibrils for roles in cell adhesion. Biomaterials. 29(11):1553-1562. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2007.11.028

19. Hoogehout et al. P. 1999. J. Peptide Res. 54436.