用温度梯度优化引物的实验方案

qPCR条件的优化

qPCR条件的优化对于开发稳健的测定非常重要。优化不良的表现是,重复实验的再现性不良,而且测定效率低下和不敏感。所采用的两种主要方法是优化引物浓度和/或退火温度。

测定优化的一种方法是通过在一系列退火温度下测试含有固定引物浓度的相同反应物来确定引物的最佳退火温度(Ta)。如果有带温度梯度仪的qPCR仪器可用,即可实现这种优化方法。在本实验方案所述的款式中,引物的终浓度为450nM,梯度仪的梯度为X轴,所有的柱经均受相同的Ta(即12个不同的温度)。在其他仪器中,梯度沿着柱向下,所有列具有相同的Ta(即8个不同的温度)。以下实验方案适用于两种仪器的任何一种,但需要进行相应的微调。


 设备

  • 具有集成式梯度仪控制功能的定量PCR仪
  • PCR设置的层流罩(选购件)


 试剂

  • 以1:5 - 1:10稀释的cDNA,gDNA 10ng,合成寡核苷酸(10,000拷贝)或其他合适的优化模板。
  • KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™(KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03;取决于仪器,参见表P17-42)。
  • PCR级水:PCR级水(W1754W4502),20 mL等分试样;冷冻;每次反应都使用新鲜的等分试样。
  • 正向和逆向引物浓缩原液(10μM工作原液:GOI)。
    •    可以在sigmaaldrich.com/oligos上订购定制的寡核苷酸。

表P17-42. SYBR Green PCR Mix选择指南。
 

热启动ReadyMixes(Taq、缓冲剂、dNTPs、参比染料、MgCl2
KiCqStart® SYBR®Green qPCR ReadyMix™, 
货号:KCQS00
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ,低Rox含量, 
货号:KCQS01
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 含ROX, 
货号:KCQS02
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ,用于iQ, 
货号:KCQS03
兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器:  
Bio-Rad CFX384™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 5700 Bio-Rad iCycler iQ™  
Bio-Rad CFX96™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7000 Bio-Rad iQ™5  
Bio-Rad MiniOpticon™ Fast Applied Biosystems ViiA 7 Applied Biosystems 7300 Bio-Rad MyiQ™  
Bio-Rad MyiQ™ Stratagene Mx3000P® Applied Biosystems 7700    
Bio-Rad/MJ Chromo4™ Stratagene Mx3005P™ Applied Biosystems 7900    
Bio-Rad/MJ Opticon 2 Stratagene Mx4000™ Applied Biosystems 7900 HT Fast    
Bio-Rad/MJ Opticon®   Applied Biosystems 7900HT    
Cepheid SmartCycler®   Applied Biosystems StepOnePlus™    
Eppendorf Mastercycler® ep realplex   Applied Biosystems StepOne™    
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s        
Illumina Eco qPCR        
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000        
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000        
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q        
Roche LightCycler®480        


 耗材

实验方案说明

  • 使用随机引发或oligo-dT引发方法产生cDNA,并以1:10稀释备用,但也可以使用任何合适的替代模板。
  • 所有反应均一式两份作为技术重复。
  • 如果使用PCR板,请按照板示意图(例如图P14-19所示)进行,以确保反应混合物样品和对照被添加到正确的孔中。


 方法

1. 根据表P14-35制备56个反应的预混合物。混合均匀,避免有气泡

表P14-35. 用于Ta优化的反应预混合物。
 

试剂 每单份20 μL反应物的体积 (μL) 56份反应物的体积 (μL)
KiCqStart SYBR® Green qPCR
ReadyMix 2×
10 560
正向引物 (10 μM) 0.9 50.4
逆向引物 (10 μM) 0.9 50.4
PCR级纯水 4.2 235.2

 

2. 将步骤1中的448 μL预混合物(即一半)移入单独的管中,以设置无模板对照(NTC)反应。

3. 将112 μL模板添加到步骤2中剩余的预混合物中。在冰上静默模板预混合物。

4. 在步骤2的预混合物的另一半中加入112 μL水。在冰上静置NTC预混合物。

5. 将步骤3中的20 μL模板预混合物等分添加到两行标记为GOI的PCR板孔中。

6. 将步骤4中的20 μL NTC预混合物等分添加到两行标记为NTC的PCR板孔中。

7. 给板盖上盖子并贴好标签。(确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。)

8. 根据以下三步实验方案运行样品(说明:这些条件是对快速循环实验方案的),确保退火温度定义在适合引物的最低和最高温度(示例显示为54-70°C)之间的梯度上。重复执行第1-3步40次。扩增后运行标准解离曲线。


表P14-36. Ta优化的快速qPCR循环条件。

快速循环条件 温度 (°C) 时间 (sec)
初始变性 / 热启动 95 30
重复执行第1-3步40次。
第1步 95 5
第2步 54–70(梯度) 15
第3步 72 10

说明:使用标准解离曲线实验方案(数据收集)。


图P14-19. 每个柱用相同Ta的Ta优化所使用的板布局。

每个柱用相同Ta的Ta优化所使用的板布局。

说明:样品和对照在温度梯度上的分布。如果仪器的温度梯度在板柱上垂直向下变化,则需要相应地重新安排样品和对照的布局。


 材料