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Pyrogen-Nachweis

Pyrogene sind fiebererzeugende Substanzen, die hauptsächlich von Bakterien bzw. anderen Mikroorganismen wie Viren oder Hefen und Schimmelpilzen stammen.

Im Pyrogen-Nachweis wird die Gegenwart oder Abwesenheit von Pyrogenen in parenteralen pharmazeutischen Produkten bestimmt. Er wird durch mehrere Normen von Organisationen wie der Food and Drug Administration (FDA), der US-Pharmakopöe (USP) oder der Europäischen Pharmakopöe (EP) reguliert. Die Sterilität eines Produkts gewährleistet nicht, dass es pyrogenfrei ist. Sterile Arzneimittel müssen daher auch auf Pyrogene getestet werden, um Fiberreaktionen bei Patienten zu vermeiden.

Eine Pyrogenkontamination kann während der Produktion oder Verabreichung von Pharmazeutika, Biotherapeutika und Medizinprodukten erfolgen. Die Gegenwart von Pyrogenen kann jedoch auch eine inhärente Eigenschaft des Produkts sein, wie z. B. Adjuvanzien in Impfstoffen oder synthetische Lipopeptide.

Was ist ein Pyrogen?

Ein Pyrogen ist eine Substanz, die einen Temperaturanstieg (Fieberreaktion) bei Menschen oder Tieren durch Aktivierung des angeborenen Immunsystems auslöst. Pyrogene sind eine heterogene Gruppe von Verunreinigungen, die mikrobielle und nicht mikrobielle Substanzen umfassen. Pyrogene können in zwei Gruppen eingeteilt werden: Endotoxine und Nicht-Endotoxin-Pyrogene (NEP). Endotoxine sind Substanzen, die in gramnegativen Bakterien vorkommen. Nicht-Endotoxin-Pyrogene sind andere mikrobielle Substanzen, einschließlich Substanzen, die von grampositiven Bakterien oder Viren stammen, sowie Pyrogene von Hefen und Schimmelpilzen. Nicht-mikrobielle Pyrogene können auch von Gummipartikeln, mikroskopischen Kunststoffpartikeln oder Metallverbindungen in Elastomeren stammen.

Für den Nachweis von Pyrogenen stehen mehrere Testmethoden zur Verfügung. Sie können, wie in der nachstehenden Tabelle aufgeführt, nach der Art der nachgewiesenen Kontamination und der Notwendigkeit des Einsatzes von tierischen Bestandteilen zur Durchführung des Tests eingeteilt werden:

Kaninchen-Pyrogentest

Beim Kaninchen-Pyrogentest (RPT) wird der Temperaturanstieg bei Kaninchen nach der intravenösen Injektion des Testprodukts gemessen. Der RPT liefert qualitative Ergebnisse und seine Empfindlichkeit ist recht niedrig. Außerdem ist die Robustheit des Tests aufgrund der Pyrogentoleranz bei Kaninchen nach wiederholten Injektionen oder aufgrund von Stress der Kaninchen bei der Durchführung des Tests begrenzt.

Monozyten-Aktivierungstest

Der Monozyten-Aktivierungstest (MAT) ist eine Alternative zu tiergestützten Methoden zum Nachweis von Endotoxinen sowie Nicht-Endotoxin-Pyrogenen (NEP). Im Monozyten-Aktivierungstest wird die humane Immunreaktion simuliert, indem Monozyten mit der Testprobe inkubiert werden. Wenn Pyrogene vorhanden sind, werden die Monozyten aktiviert und produzieren inflammatorische Moleküle, Cytokine, die für die Fieberreaktion verantwortlich sind. Die Cytokine werden dann in einem immunologischen Assay (ELISA) mit spezifischen Antikörpern und einer enzymatischen Farbreaktion nachgewiesen.

Hinweis: Das zuständige Direktorat für die Europäische Pharmakopöe (Ph Eur) hat beschlossen, einen Weg einzuschlagen, der letztlich dazu führen soll, dass der Kaninchen-Pyrogentest (RPT) in der Ph Eur innerhalb von etwa 5 Jahren vollständig ersetzt wird.
Lesen Sie den Artikel und diskutieren Sie mit unseren Experten darüber, um eine Umstellung einzuleiten.

Bakterieller Endotoxintest (LAL-Test)

Die gebräuchlichste Methode des Endotoxin-Nachweises ist der Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL)-Test. Dieser Test basiert auf dem Lysat von Amöbozyten aus Pfeilschwanzkrebsblut. Das Lysat aus Blutzellen des Pfeilschwanzkrebses reagiert naturgemäß mit bakteriellen Endotoxinen in einer Koagulationsreaktion. Diese Methode weist eine hohe Empfindlichkeit für die Quantifizierung von Endotoxinen auf, Nicht-Endotoxin-Pyrogene werden jedoch nicht nachgewiesen.

Nachweis des rekombinanten Faktors C (rFC)

Der rekombinante Faktor C ist ein gentechnisch hergestelltes Protein, das normalerweise in der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Kaskade vorkommt. In diesem Test reagiert Faktor C mit Endotoxin und koppelt mit einem Marker, wobei ein quantifizierbares, fluoreszentes Endprodukt gebildet wird. Im rFC-Test wird das gleiche Prinzip wie im LAL-Test eingesetzt, er erfordert jedoch keine Bestandteile tierischen Ursprungs.


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