L’importanza della filtrazione per ottimizzare le prestazioni in (U)HPLC e LC-MS
- La filtrazione in UHPLC, HPLC e LC-MS
- Ritenzione particellare di diversi filtri da siringa
- Studio sulla durata delle colonne per HPLC con e senza filtrazione dei campioni
- Studio dei filtri a membrana per la filtrazione della fase mobile
- Filtrazione, ostruzione della colonna e analisi HPLC
- Prodotti in evidenza
- Bibliografia
Filtri da siringa Millex® per la filtrazione di campioni da analizzare in HPLC
Filtri a membrana e portafiltri Millipore® per la filtrazione di solventi/ fase mobile
È risaputo che un’opportuna tecnica di preparazione dei campioni è fondamentale per ottenere risultati di alta qualità. Talvolta, i campioni da analizzare in (U)HPLC o LC-MS vengono preparati omettendo la fase di filtrazione, ma ciò può causare conseguenze indesiderate poiché la presenza di particelle nei campioni e nelle fasi mobili può compromettere le prestazioni della colonna e dello strumento. Abbiamo studiato i filtri da siringa Millex® per quanto riguarda la capacità di trattenere le particelle e li abbiamo confrontati con altri filtri da siringa. L’efficienza di ritenzione delle particelle (ritenzione percentuale) è stata poi correlata alla durata della colonna, in uno studio in cui campioni filtrati e non filtrati venivano iniettati in un sistema UHPLC monitorando la contropressione fino a 500 iniezioni o fino al superamento di un valore soglia di pressione stabilito. Abbiamo anche studiato l'impatto sulla contropressione della colonna della filtrazione della fase mobile. I dati ottenuti dimostrano l'importanza della filtrazione per ottimizzare la durata della colonna HPLC.
La filtrazione in UHPLC, HPLC e LC-MS
La cromatografia liquida ad alte prestazioni e a ultra alte prestazioni (HPLC, UHPLC) e la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) sono metodi analitici comunemente impiegati nello sviluppo di farmaci e nel CQ farmaceutico, nei laboratori di ricerca accademici e pubblici, nell'analisi di alimenti e bevande e nei test clinici e ambientali. Una delle tecniche di preparazione del campione più semplici e meno costose è la filtrazione, che consiste nella rimozione delle particelle presenti nel campione.1 Il particolato non disciolto di un campione ha la capacità di intasare la colonna da HPLC, anche a basse concentrazioni, causando un'elevata contropressione dello strumento e una riduzione della durata della colonna, nonché una scarsa qualità dei dati.2,3 Pertanto, la rimozione di queste particelle dai campioni mediante filtrazione può evitare queste problematiche e nello stesso tempo contribuisce a produrre dati cromatografici migliori.4
La filtrazione è importante anche nella preparazione delle fasi mobili per (U)HPLC e LC-MS.5,6,7 I solventi per HPLC, UHPLC, LC-MS e MS disponibili in commercio sono pre-filtrati e non richiedono un'ulteriore filtrazione se utilizzati direttamente dalla bottiglia come fase mobile. Tuttavia, molti metodi prevedono fasi mobili costituite da tamponi e/o miscele e richiedono l'aggiunta di sali, come fosfati e acetati.8 In questi casi, si raccomanda di filtrare il tampone prima dell'uso,9 e di usare sempre tampone fresco.8
Abbiamo esaminato l'efficienza di ritenzione di vari filtri da siringa e confrontato la durata delle colonne con e senza filtrazione dei campioni.
Efficienza di ritenzione particellare di diversi filtri da siringa
L'efficienza di ritenzione è un indicatore della percentuale di particelle che viene rimossa con successo da un campione durante la filtrazione o di quella che viene lasciata passare attraverso il filtro e nello strumento. Abbiamo determinato la ritenzione particellare di filtri da siringa di quattro produttori realizzati in politetrafluoroetilene (PTFE) idrofilo o in cellulosa rigenerata (CR). Si è proceduto misurando la ritenzione di microsfere di 0,5 μm di diametro da parte di filtri da siringa da 0,45 μm e di microsfere di 0,24 μm di diametro da parte di filtri da siringa da 0,2 μm dopo filtrazione di soluzioni di microsfere allo 0,05% (v/v) in acqua. La soluzione di microsfere è stata filtrata con n=4 filtri da siringa per ogni lotto e, nella maggior parte dei casi, si sono presi in esame più lotti. Il filtrato è stato raccolto dopo aver filtrato 3 mL di soluzione di microsfere e quindi caratterizzato in fluorescenza o spettrofotometricamente rispetto a una curva standard a sei punti.
La tabella 1 mostra l'efficienza di ritenzione dei quattro filtri da siringa da 0,45 μm esaminati. L'efficienza di ritenzione variava al variare del materiale di fabbricazione della membrana, con la ritenzione più bassa (48,2+/-4,3%) per la CR; i filtri da siringa in PTFE, invece, hanno mostrato una ritenzione delle microsfere di polistirene del 98-100% circa.
Produttore (PDT) | Materiale | Indicazione del lotto | Ritenzione % | |
|---|---|---|---|---|
Individuale (n=4 unità) | Media (tutti i lotti) | |||
Filtri da siringa Millex® | PTFE (idrofilo) | 1a | 96,6 ± 0,10 | 98,3 ± 1,8 |
1b | 100 ± 0,10 | |||
PDT #2 | PTFE (idrofilo) | 2a | 100 ± 0,10 | 100 ± 0,10 |
2b | 100 ± 0,10 | |||
PDT #3 | PTFE (idrofilo) | 3a | 100 ± 0,10 | 100 ± 0,10 |
PDT #4 | Cellulosa rigenerata (CR) | 4a | 52,6 ± 3,6 | 48,2 ± 4,3 |
4b | 45,1 ± 2,8 | |||
4c | 46,8 ± 1,8 | |||
In HPLC, la filtrazione attraverso una membrana filtrante da 0,45 µm è sufficiente, a meno che la colonna non sia impaccata con particelle di piccole dimensioni (ad es, particelle di diametro inferiore a 2 µm, o UHPLC), nel qual caso è necessario un filtro da 0,2 μm.5,10 Le colonne da UHPLC sono più inclini all'intasamento perché presentano porosità delle fritte in ingresso, spazi interstiziali e diametro dei tubi minori. Pertanto, si è valutata anche la ritenzione di microsfere di 0,24 μm di diametro da parte di filtri da siringa da 0,2 μm (Tabella 2). L'efficienza di ritenzione del filtro in CR è inferiore al 20%, il che significa che oltre l'80% del particolato da filtrare attraversa la membrana. I tre filtri da siringa in PTFE idrofilo hanno mostrato efficienze di ritenzione diversificate, con il filtro del PDT #2 che ha registrato il valore più basso in assoluto oltre a mancanza di uniformità al variare del lotto di produzione.
Produttore (PDT) | Materiale | Indicazione del lotto | Ritenzione % | |
|---|---|---|---|---|
Individuale (n=4 unità) | Media (tutti i lotti) | |||
Filtri da siringa Millex® | PTFE (idrofilo) | 1a | 96,7 ± 0,70 | 96,0 ± 1,6 |
1b | 95,4 ± 1,9 | |||
PDT #2 | PTFE (idrofilo) | 2a | 78,8 ± 17 | 49,8 ± 32 |
2b | 20,9 ± 0,90 | |||
PDT #3 | PTFE (idrofilo) | 3a | 98,5 ± 1,5 | 98,5 ± 1,5 |
PDT #4 | Cellulosa rigenerata (CR) | 4a | 14,4 ± 1,1 | 15,8 ± 2,2 |
4b | 14,2 ± 0,70 | |||
4c | 18,7 ± 0,60 | |||
I dati sull'efficienza di ritenzione suggeriscono che, a parità di dimensioni dei pori, i filtri da siringa non forniscono necessariamente prestazioni identiche nella filtrazione dei campioni.
Studio sulla durata delle colonne per HPLC con e senza filtrazione dei campioni
Si è condotto uno studio sulla durata delle colonne iniettando ripetutamente 10 μL di soluzioni di microsfere allo 0,05% (v/v) filtrate o non filtrate. I campioni venivano filtrati in 30 fiale certificate HPLC utilizzando n=30 unità dei filtri da siringa da 0,45 μm esaminati in precedenza. Nella maggior parte dei casi, sono stati testati più lotti. Dopo ogni iniezione, si monitorava la variazione della contropressione, fino a 500 iniezioni in colonna o fino a un valore soglia di pressione predefinito a 8.000 psi, per garantire che il sistema non raggiungesse livelli di pressione rischiosi. Le condizioni di esecuzione delle corse HPLC sono riportate in
Tabella 3.
Colonne | Ascentis® Express C18, 2,7μm, 50 × 2,1mm D.I. |
Fase mobile | Acetonitrile:acqua; 35:65 filtrata con una membrana in PTFE idrofilo da 0,2 μm utilizzando una |
Flusso | 0,75 mL/min |
Temp. colonna | 35,0°C |
Volume di iniezione | 10 μL |
Valore soglia per la contropressione | 8.000 psi |
Si utilizzava una nuova colonna in ogni test per ciascuna tipologia di filtro da siringa da 0,45 μm. I tubi, l'iniettore, le guarnizioni e il sistema HPLC venivano tutti lavati a fondo tra un test e l'altro, sia con la colonna installata, sia senza, per garantire che tutte le particelle delle corse precedenti fossero state eliminate dal sistema. Una volta installata una nuova colonna, il sistema veniva sottoposto a flussaggio con acetonitrile:acqua 70:30 (1 mL/min) per 10 minuti e poi equilibrato con la fase mobile (Tabella 3) fino a quando la linea di base della contropressione non si fosse stabilizzata, circa 10-15 minuti.
Soluzioni allo 0,05% (v/v) di microsfere di polistirene del diametro di 0,5 μm venivano filtrate in fiale certificate HPLC con filtri da siringa da 0,45 μm. I filtrati venivano poi iniettati nell’UHPLC. Si effettuavano iniezioni ripetute di soli 10 μL fino a raggiungere o a superare il valore soglia stabilito per la contropressione (8.000 psi). Venivano iniettati direttamente anche campioni non filtrati. I risultati ottenuti sono presentati nella Figura 1.
Figura 1. Effetto della filtrazione dei campioni sulla contropressione del sistema UHPLC. La contropressione media (psi) è stata rappresentata in grafico in funzione del numero di iniezioni di soluzioni di microsfere di 0,5 μm di diametro allo 0,05% (v/v), filtrate e non filtrate. I campioni filtrati provenivano da tre filtri da siringa in PTFE idrofilo e da un filtro da siringa in CR da 0,45 μm, ciascuno di un produttore diverso (PDT). Sono state iniettate anche soluzioni non filtrate.
Con i campioni non filtrati sono state effettuate solo 36 iniezioni prima che la contropressione superasse il valore limite di 8.000 psi. La soglia veniva superata dopo 71 iniezioni con i filtrati dei filtri da siringa in CR. Ciò indica che la colonna è stata intasata rapidamente dalle particelle e che anche iniezioni di soli 10 μL ne hanno ridotto significativamente la durata. Ciò è correlato ai dati sull'efficienza di ritenzione, in cui il filtro da siringa in CR ha trattenuto solo il 48% delle particelle in soluzione, il che significa che circa il 50% del particolato da filtrare è stato invece iniettato nel sistema UHPLC. Tutti i campioni filtrati con il PTFE hanno potuto essere iniettati più di 500 volte senza che si registrassero variazioni apprezzabili nella contropressione della colonna, perché quasi il 100% delle particelle è stato trattenuto da questi filtri da siringa, come descritto in precedenza.
Studio dei filtri a membrana per la filtrazione della fase mobile
L’importanza della filtrazione nelle applicazioni di (U)HPLC e LC-MS non riguarda soltanto la filtrazione dei campioni. Anche la presenza di particelle nella fase mobile, infatti, può causare problemi seri nelle analisi (U)HPLC. In uno studio precedente, Joshi et. al. hanno dimostrato che persino una rimozione incompleta delle particelle dalla fase mobile provoca un aumento della contropressione della colonna UHPLC (Figura 2).7,11 In tale studio, la fase mobile composta da acetonitrile:acqua 50:50 veniva filtrata attraverso filtri a membrana in polipropilene (PP) e PTFE idrofilo (dimensioni dei pori 0,2 μm e 0,45 μm). La fase mobile veniva fatta fluire in continuo in una colonna UHPLC con un flusso di 0,25 ml/min, monitorando la contropressione per 600 minuti.
Figura 2. Variazione della contropressione di un sistema UHPLC (psi) in funzione del tempo (min) con flusso della fase mobile di 0,25 mL/min per 600 minuti. La fase mobile veniva filtrata con membrane di polipropilene (PP) e PTFE da 0,2 e 0,45 μm. (Ristampato con l’autorizzazione degli autori del riferimento bibliografico11).
Dei quattro filtri a membrana testati, con le membrane in polipropilene da 0,45 μm e 0,2 μm si è verificato il maggiore aumento di contropressione. Oltre a causare gli stessi problemi alla colonna già discussi, il particolato nella fase mobile può provocare la rottura prematura dei componenti dello strumento, come le valvole di non ritorno, i pistoni e le guarnizioni della pompa.12 È importante notare che il volume di fase mobile che entra in contatto con la colonna durante un esperimento è significativamente più elevato rispetto a quello del campione iniettato; pertanto, se la fase mobile contiene del particolato, può accelerare e aggravare gli effetti di intasamento della colonna osservati.
Fattori che influenzano l’efficienza di ritenzione dei filtri a membrana
La filtrazione dei campioni e delle fasi mobili è stata eseguita utilizzando filtri a membrana, che fungono da barriere microporose. I pori delle membrane sono responsabili dell'esclusione delle particelle dalla massa della matrice in base alle dimensioni fisiche. Tuttavia, possono verificarsi situazioni in cui particelle più grandi delle dimensioni dei pori di una membrana attese o dichiarate possono attraversare il filtro, o in cui, viceversa, particelle più piccole non riescono a passare, determinando efficienze di ritenzione che si discostano da quelle previste.
Sono diverse le caratteristiche dei pori di un microfiltro che determinano come il filtro tratterrà le particelle di determinate dimensioni: forma, dimensioni, frequenza, distribuzione e simmetria. In questo studio sulla ritenzione, unità filtranti differenti e di diversi produttori, ma tutte in PTFE e con pori della stessa dimensione hanno mostrato una efficienza di ritenzione diversificata nei confronti delle medesime particelle, specialmente i filtri con pori di 0,2 µm di diametro. Ciò può essere dovuto a una distribuzione dimensionale dei pori e a una porosità più ampie o più limitate al variare del produttore. In altre parole, l’intervallo di distribuzione delle dimensioni dei singoli pori, dal più piccolo al più grande, può essere molto diverso. Il processo di colata delle membrane, anche dello stesso materiale, varia al variare del produttore. La forma dei pori risultante può quindi variare notevolmente tra un prodotto e l'altro e talvolta addirittura tra lotti diversi, soprattutto se il processo non viene controllato attentamente. Inoltre, i produttori possono avvalersi di metodi diversi per misurare la porosità di una membrana e la dimensione dei pori, come i test di permeabilità all'aria, punto di bolla, permeabilità all'acqua pura, analisi BET, porometria o il test di ritenzione.
Quando si utilizzano filtri da siringa per la preparazione dei campioni da analizzare in (U)HPLC e LC-MS, l’efficienza di ritenzione delle particelle non è l'unica caratteristica da considerare. Anche altri aspetti, come le compatibilità e più in generale le caratteristiche chimiche della membrana, il diametro, lo spessore e l'alloggiamento del filtro, nonché le caratteristiche chimiche della soluzione da filtrare e degli analiti, possono avere un impatto significativo sulle prestazioni complessive del filtro a membrana.13
Filtrazione, ostruzione della colonna e analisi HPLC
La filtrazione dei campioni prima delle analisi (U)HPLC è considerata una buona pratica5 che, prevenendo l'intasamento prematuro della colonna e l'aumento di contropressione dello strumento, evita fermi macchina non necessari e la conseguente perdita di produttività del laboratorio e mantiene inalterata la qualità dei dati. I risultati degli studi sull'efficienza di ritenzione suggeriscono che quando vengono utilizzati per filtrare campioni contenenti particelle prima delle iniezioni nell’(U)HPLC, i filtri da siringa possono offrire una protezione delle colonne diversificata.
Filtri da siringa con la stessa classificazione per quanto riguarda le dimensioni dei pori possono avere efficienze di ritenzione delle particelle diverse. Per proteggere la colonna (U)HPLC da un intasamento prematuro, è importante scegliere un filtro che trattenga efficacemente le particelle. Anche le fasi mobili devono essere filtrate perché il particolato non solo causa l'intasamento della colonna, ma nel tempo può anche provocare la rottura dei componenti dello strumento. Pertanto, per prolungare la durata della colonna HPLC e per produrre dati coerenti e di alta qualità, si deve sempre prendere in considerazione la filtrazione sia del campione che della fase mobile.
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