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溶解・タンパク質抽出

ヒト細胞

機能研究または構造研究、あるいは調整処理と産生を目的としてタンパク質を精製する場合の最初のステップは、細胞または組織を破壊して、標的タンパク質にアクセスできるようにすることです。細胞溶解とタンパク質可溶化は、効果的な分析と効率的な処理の鍵となります。抽出方法には、酵素、化学物質、または機械を使った方法、あるいはそれらの組み合わせを選択できます。


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分析のために細胞を分解し内容物を準備するために、多くの方法が利用できます。一般に、サンプルが容易に溶解する培養細胞や血液細胞からなる場合には穏やかな方法が利用され、一方、より頑丈な細菌や植物細胞または結合組織に埋まった哺乳類細胞の破壊にはより強力な方法が利用されます。

  • 界面活性剤による溶解:界面活性剤による溶解:界面活性剤による溶解は、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母、および植物に使用できる穏やかな溶解法です。細胞懸濁液は、細胞膜を破壊する働きをする界面活性剤を含んだ溶解溶液中で穏やかに分離され、再懸濁されます。細胞膜が可溶化され、細胞が溶解して細胞内の成分がリリースされます。界面活性剤が分析や産生に支障をきたす場合は、下流工程で界面活性剤を除去する必要が生じることがあります。
  • 凍結融解溶解:この方法は、哺乳類または細菌細胞の懸濁に適用できます。細胞懸濁液を液体窒素を用いて迅速に凍結させます。次に、このサンプルを解凍し、溶解バッファー中でピペッティングまたは穏やかにボルテックスすることによって再懸濁し、何度かこのプロセスを繰り返します。サイクルの合間に、サンプルを遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を保持します。
  • 浸透圧ショック:これは、界面活性剤を使用せずに懸濁した哺乳類または細菌細胞を溶解するのに十分な非常に穏やかな方法です。この方法(しばしば、機械的破壊と組み合わせられます)は、高浸透圧培地から低浸透圧培地へ変化させることに依拠する方法で、後に溶解物を細胞成分に分画する用途に非常に適しています。
  • 超音波処理:このタンパク質抽出方法は、細胞懸濁液に最も頻繁に適用されます。細胞は、サンプル中に挿入したプローブを介して高周波数音波によって破壊されます。音波は、低圧の領域を作り出して、細胞膜を破壊します。
  • 機械的方法:さまざまな大雑把ですが効果的な「破砕とすりつぶし」の方法を用いて、細胞や組織からタンパク質を抽出できます。例えば、細胞膜は、ダウンスまたはポッター・エルベージェムホモジナイザーを用いて液体剪断力により破壊できます。組織は、ワーリングブレンダーまたはポリトロン®(Polytron ®)ホモジナイザーを用いて冷蔵バッファー中で細断または細分化することによってホモジナイズできます。組織または細胞は、液体窒素中で凍結して、アルミナまたは砂と共に乳鉢と乳棒を使って細かい粉末状にすることもできます。微細なガラスビーズと共に細胞を素早く撹拌して、細胞壁を破壊します。これは、ほとんどのグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して有効です。
  • 酵素消化:酵素消化:酵素法は、細胞膜が頑丈な保護構造に取り巻かれた細菌、酵母、または繊維組織中に埋まった真核生物細胞からタンパク質を抽出する時にしばしば用いられる方法です。リゾチーム、ムタノリシン、メタポリザイム、リゾナーゼ、プロナーゼなどの細胞溶解酵素やカクテルを組織消化酵素(コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアロロニダーゼなど)と組み合わせて使用すると、機械だけを使った方法では簡単に剪断されない構造物(細胞壁、外皮、莢膜、カプシドなど)を溶解または破壊することができます。酵素消化の後に、溶解バッファー中でのホモジナイズ、超音波処理、または強いボルテックスを続けて行うこともあります。

さらに、内在性プロテアーゼおよびホスファターゼが細胞破壊により遊離されて標的分子を分解するので、標的分子が意図せず損傷することを避けるために、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを用いて、細胞破壊およびその後の精製中に、サンプルを保護すべきです。