安定同位体標識タンパク質標準物質を定量する、妥当性が確認されたアミノ酸分析アッセイ：SILチログロブリンの事例

図1.対照BSAを重量測定法によりSRM927を希釈して調製します。Tg試料を重量測定法により約150μg/mLまで希釈します。すべての対照と試料を重量測定法により加水分解チューブに分注します。内部標準物質を添加した後、試料を加水分解、標識化し、LC-UV（Waters AccQ-Fluorキット、製品番号WAT052880）により分析します。キャリブレーション標準物質はSRM2389から重量測定法により調製します。

図2.PNGase F（製品番号P7367）で脱グリコシル化後、4種類のタンパク質分解酵素によるペプチドマッピングから得たSIL-チログロブリンのコンポジットシーケンスがカバーする範囲は92%超でした。使用したタンパク質分解酵素はトリプシン（製品番号T6567）、GluC、AspN（製品番号P3303）、およびキモトリプシンでした。酵素消化後、Waters Acquity M ClassをWaters XEVO-G2S QTOFにつないで使用するRP LC-MS/MSでSIL-チログロブリン試料を分析しました。Waters BEH130 C18 100mm x 100µM x 1.7µMカラムを以下のLC条件で使用しました。流量750 nL／分、0.1%ぎ酸含有水溶液（製品番号56302）を移動相A、アセトニトリル（製品番号34967）を移動相Bとし、移動相Bからグラジエント1%で開始して、45分間で移動相Bを1～40%、47分間で移動相Bを40～90%とし、49分間で移動相Bを90%、51分間で移動相Bを90～1%とし、最後に80分間で移動相Bを1%とする。

図3.SIL-チログロブリンから遊離させた2種類のサロゲートペプチド中の13C6 15N4で標識したアルギニンの組込率は98%超でした。まず、SIL-チログロブリンをトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（製品番号C4706）溶液中で還元し、次にヨードアセトアミド（製品番号A3221）でアルキル化した後、トリプシン（製品番号T6567）で消化しました。酵素消化後、Waters Acquity M ClassをWaters XEVO-G2S QTOFにつないで使用するRP LC-MS/MSでSIL-チログロブリンを分析しました。2本のSupelco BIOshell A160 Peptide C18 15cm x 300µM x 2.7µMカラム（製品番号67093-U）を以下のLC条件で縦に並べて動作させました。流量10 μL／分、0.1%ぎ酸含有水溶液（製品番号56302）を移動相A、アセトニトリル（製品番号34967）を移動相Bとし、60分間で移動相Bをグラジエント3～45%とし、61分間で移動相Bを45～90%とし（2分間保持）、64分間で移動相Bを90～3%とする。

図4.95%超の純度を示すSIL-チログロブリンのSDS-PAGE。まず、試料を2倍濃度のLaemmli試料バッファー（製品番号S3401）を使用して還元しました。次に、250ngの試料を分子量マーカーのSigmaMarker（製品番号S8445）とともにゲルにロードしました。電気泳動後、ゲルをSYPRO Rubyゲル染色液（製品番号S4942）で染色した後、可視化しました。

図5.図1に示したAAAを使用してNIST SRM 927を測定しました。AAAを使用して測定した平均値はNISTが報告したSRM 927の拡張不確かさ以内に入っています。平均値±95%信頼水準の拡張不確かさを示します。

図6.図1に示したAAAを使用してTg CRM 457を測定しました。測定した平均値はBCRがAAA1に対して報告した拡張不確かさ以内に入っていますが、Lowryアッセイが測定したラベル要求のものよりはるかに低く（約30%）なっています。平均値±95%信頼水準の拡張不確かさを示します。