Merck
ホームキャリブレーション、クオリフィケーションおよびバリデーション安定同位体標識タンパク質標準物質を定量するアミノ酸分析アッセイ

安定同位体標識タンパク質標準物質を定量する、妥当性が確認されたアミノ酸分析アッセイ:SILチログロブリンの事例

Kevin Ray , Pegah, R , Jalili , Mark Angeles , James, J , Walters , Isil Dilek , and Uma Sreenivasan

概要

生体試料マトリックス中のタンパク質を測定するための質量分析法の登場により、標準物質開発の重要性が継続して増大します。計量学的に有効な手順によって値を割り当てられた認証標準物質は、タンパク質の抽出、分画、濃縮、分解、および分析を含むワークフローのすべてのステップで、実験のばらつきを最小限に抑えて管理する上で重要です。

メルクは、定量的MSワークフローで内部標準物質として使用するための安定同位体標識(SIL)全長チログロブリンを製造しており、配列の忠実度と同位体の組み込み率を検証しています。

また、NIST SRM 2389にトレーサブルなアミノ酸分析(AAA)法を開発し、その妥当性をNIST SRM 927に照らして確認しています。このAAA法をタンパク質の正確な定量に使用すれば、確度に基づくタンパク質標準物質を開発できます。

SIL-チログロブリンの特性評価

表1.

AAAワークフローの概説

対照BSAを重量測定法によりSRM927を希釈して調製します。

図1.対照BSAを重量測定法によりSRM927を希釈して調製します。Tg試料を重量測定法により約150μg/mLまで希釈します。すべての対照と試料を重量測定法により加水分解チューブに分注します。内部標準物質を添加した後、試料を加水分解、標識化し、LC-UV(Waters AccQ-Fluorキット、製品番号WAT052880)により分析します。キャリブレーション標準物質はSRM2389から重量測定法により調製します。

SIL-チログロブリンの配列検証

PNGase Fで脱グリコシル化後、4品目のタンパク質分解酵素によるペプチドマッピングから得たSIL-チログロブリンのコンポジットシーケンスがカバーする範囲

図2.PNGase F(製品番号P7367)で脱グリコシル化後、4種類のタンパク質分解酵素によるペプチドマッピングから得たSIL-チログロブリンのコンポジットシーケンスがカバーする範囲は92%超でした。使用したタンパク質分解酵素はトリプシン(製品番号T6567)、GluC、AspN(製品番号P3303)、およびキモトリプシンでした。酵素消化後、Waters Acquity M ClassをWaters XEVO-G2S QTOFにつないで使用するRP LC-MS/MSでSIL-チログロブリン試料を分析しました。Waters BEH130 C18 100mm x 100µM x 1.7µMカラムを以下のLC条件で使用しました。流量750 nL/分、0.1%ぎ酸含有水溶液(製品番号56302)を移動相A、アセトニトリル(製品番号34967)を移動相Bとし、移動相Bからグラジエント1%で開始して、45分間で移動相Bを1~40%、47分間で移動相Bを40~90%とし、49分間で移動相Bを90%、51分間で移動相Bを90~1%とし、最後に80分間で移動相Bを1%とする。

SIL-チログロブリンの同位体組込率

SIL-チログロブリンから遊離させた2品目のサロゲートペプチド中の13C6 15N4で標識したアルギニンの組込率

図3.SIL-チログロブリンから遊離させた2種類のサロゲートペプチド中の13C6 15N4で標識したアルギニンの組込率は98%超でした。まず、SIL-チログロブリンをトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(製品番号C4706)溶液中で還元し、次にヨードアセトアミド(製品番号A3221)でアルキル化した後、トリプシン(製品番号T6567)で消化しました。酵素消化後、Waters Acquity M ClassをWaters XEVO-G2S QTOFにつないで使用するRP LC-MS/MSでSIL-チログロブリンを分析しました。2本のSupelco BIOshell A160 Peptide C18 15cm x 300µM x 2.7µMカラム(製品番号67093-U)を以下のLC条件で縦に並べて動作させました。流量10 μL/分、0.1%ぎ酸含有水溶液(製品番号56302)を移動相A、アセトニトリル(製品番号34967)を移動相Bとし、60分間で移動相Bをグラジエント3~45%とし、61分間で移動相Bを45~90%とし(2分間保持)、64分間で移動相Bを90~3%とする。

SIL-チログロブリンの純度確認

95%超の純度を示すSIL-チログロブリンのSDS-PAGE。まず、試料を2倍濃度のLaemmli試料バッファー(製品番号S3401)を使用して還元しました。次に、250ngの試料を分子量マーカーのSigmaMarker(製品番号S8445)とともにゲルにロードしました。電気泳動後、ゲルをSYPRO Rubyゲル染色液(製品番号S4942)で染色した後、可視化しました。

図4.95%超の純度を示すSIL-チログロブリンのSDS-PAGE。まず、試料を2倍濃度のLaemmli試料バッファー(製品番号S3401)を使用して還元しました。次に、250ngの試料を分子量マーカーのSigmaMarker(製品番号S8445)とともにゲルにロードしました。電気泳動後、ゲルをSYPRO Rubyゲル染色液(製品番号S4942)で染色した後、可視化しました。

AAAアッセイの性能指数

表2.異なる3日、異なる3つの加水分解時間(20、22、および24時間)、異なる2人の科学者によってそれぞれ3回超、4つの異なる加水分解チャンバーの試験を含む妥当性確認プロトコル

BSA-SRM 427の値割当て

図1に示したAAAを使用してNIST SRM 927を測定しました。AAAを使用して測定した平均値はNISTが報告したSRM 927の拡張不確かさ以内に入っています。平均値±95%信頼水準の拡張不確かさを示します。

図5.図1に示したAAAを使用してNIST SRM 927を測定しました。AAAを使用して測定した平均値はNISTが報告したSRM 927の拡張不確かさ以内に入っています。平均値±95%信頼水準の拡張不確かさを示します。

TG-CRM 457の値割当て

図1に示したAAAを使用してTg CRM 457を測定しました。測定した平均値はBCRがAAA1に対して報告した拡張不確かさ以内に入っていますが、Lowryアッセイが測定したラベル表示のものよりはるかに低く(約30%)なっています。平均値±95%信頼水準の拡張不確かさを示します。

図6.図1に示したAAAを使用してTg CRM 457を測定しました。測定した平均値はBCRがAAA1に対して報告した拡張不確かさ以内に入っていますが、Lowryアッセイが測定したラベル要求のものよりはるかに低く(約30%)なっています。平均値±95%信頼水準の拡張不確かさを示します。

要約

  • NIST SRM 2389にトレーサブルなアミノ酸分析(AAA)法の妥当性を確認し、確度に基づくタンパク質標準物質の値割当てを可能にしました。
  • SIL-Tgの特性評価により、SDS-PAGEによる配列カバー範囲は92%超、同位体組込率は98%超、純度は95%超であることが示されました。
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1.
1994. ヒトサイログロブリン標準物質の精製と認証、CRM 457最終報告書、欧州委員会コミュニティ基準局.