Merck
HomeProduzione di vacciniStrategie produttive per i vaccini e gli agenti terapeutici a mRNA

Strategie produttive per i vaccini e gli agenti terapeutici a mRNA

Laurens Vergauwen, Ricercatore Process Development, Nargisse El Hajjami, Associate Director del Dipartimento Cell and Gene Therapy, Manuel Brantner, Associate Director del Dipartimento Vaccine and Plasma, Shiksha Mantri, Global Marketing Manager del Dipartimento mRNA Applications, Bahar Cebi, Marketing Manager del Dipartimento Novel Modalities & Vaccines

Merck

I sistemi di trasporto virale quali i vettori basati su virus adenoassociati (AAV) sono ben collaudati e il loro uso per la veicolazione di vaccini e terapie geniche è stato approvato. Nonostante siano diffusamente utilizzati, tali sistemi possono comportare problemi di immunogenicità ed effetti indesiderati sistemici più frequenti rispetto ad altri approcci. Senza contare che il processo di produzione può risultare complesso e che le applicazioni di terapia genica richiedono titoli elevati.

Al contrario, i sistemi di veicolazione non virali dovrebbero garantire un profilo di sicurezza migliore e, grazie a un processo produttivo semplificato, offrono la possibilità di standardizzare i processi.

Latecnologia a mRNA si avvale di sistemi di veicolazione non virali e offre una grande versatilità. Il rilascio di un mRNA nel citosol di una cellula può indurre la sintesi di una proteina target, la quale può funzionare come agente terapeutico o di profilassi, agire da antigene per innescare una risposta immunitaria a scopi vaccinali, sostituire una proteina difettosa o attivare una risposta antitumorale.

I robusti risultati preliminari ottenuti con i tre vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 hanno implicazioni che vanno ben oltre l'attuale pandemia e fanno ben sperare circa l’uso di un simile approccio nella lotta contro il cancro, le malattie cardiache e altre malattie infettive.

Considerazioni sulla produzione di mRNA

Lo sviluppo e la produzione di mRNA a fini terapeutici e vaccinali sono processi relativamente semplici, scalabili ed estremamente rapidi (Figura 1). Considerato il breve arco temporale richiesto per il passaggio dallo sviluppo agli studi clinici e quindi all'approvazione, la tecnologia a mRNA risulta molto promettente non solo in risposta a eventuali epidemie di malattie infettive e a pandemie, ma anche per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per affrontare malattie con necessità terapeutiche ancora senza risposta.

L'mRNA è prodotto attraverso un processo enzimatico di sintesi in vitro, che consente di evitare le lunghe fasi di clonaggio e amplificazione richieste dalla classica espressione in vivo di proteine. Essendo un processo di sintesi in vitro , offre il vantaggio di non dover rimuovere le cellule o le proteine della cellula ospite. Questo processo di produzione semplificato utilizza gli stessi reagenti e recipienti di reazione per qualsiasi target, consentendo agli impianti che osservano le GMP di convertire la produzione a una nuova proteina target in tempi brevissimi, con minimi adattamenti del processo e della formulazione.

Panoramica generale del processo per la produzione di mRNA

Figura 1.Panoramica generale del processo per la produzione di mRNA.

Produzione di mRNA

La produzione di agenti terapeutici e vaccini a base di mRNA inizia tipicamente o frequentemente con un DNA plasmidico (pDNA) stampo contenente un promotore per la RNA polimerasi DNA-dipendente e la sequenza corrispondente al costrutto di mRNA. Dato il ruolo centrale del costrutto del pDNA, la sua progettazione e la sua purezza sono fattori cruciali per ottimizzare l'mRNA prodotto. La produzione e la purificazione del pDNA comportano una serie di inconvenienti quali le grandi dimensioni dell'acido nucleico e la sua elevata viscosità, nonché la sua suscettibilità alla frammentazione e la sua somiglianza alle impurezze. Le strategie per ovviare a tali problemi sono trattate nel nostro webinar "Scalable purification of Plasmid DNA" (Purificazione scalabile del DNA plasmidico).

Il costrutto dell’mRNA è concepito in modo da garantire un’espressione efficiente del gene di interesse. La stabilità, l'espressione genica e l'efficienza di traduzione della proteina dipendono da diversi elementi strutturali (Figura 2):

struttura dell'mRNA

Figura 2.struttura dell'mRNA.

  • La regione del cap all'estremità 5' della sequenza è essenziale per la maturazione dell'mRNA e consente al ribosoma di riconoscere l'mRNA per un’efficiente traduzione nella proteina. Il cap ha inoltre la funzione di stabilizzare l’mRNA proteggendolo dalla digestione da parte delle nucleasi.
  • Le regioni non tradotte (UTR) situate nei domini a monte e a valle della regione codificante dell'mRNA ne influenzano l’efficienza di traduzione, la stabilità e la localizzazione e possono essere sfruttate per rendere più efficiente l’espressione proteica.
  • La open reading frame (sequenza codificante la proteina) contiene il gene di interesse (GOI).
  • La coda di poli-(A) è cruciale per la traduzione della proteina e per la stabilità dell'mRNA, perché impedisce la digestione da parte dell’attività esonucleasica 3’-5’.

Il pDNA viene quindi amplificato all'interno di cellule batteriche, tipicamente E. coli, e grazie alle successive fasi di purificazione si ottiene un pDNA circolare, puro e concentrato, che viene poi linearizzato per fungere da stampo per la RNA polimerasi che trascrive l'mRNA desiderato.

La linearizzazione è necessaria per evitare eventi di readthrough trascrizionale che potrebbero generare forme indesiderate di mRNA e quindi impurezze aggiuntive che andrebbero poi rimosse. La linearizzazione si ottiene miscelando il DNA plasmidico con un enzima di restrizione in un tampone di reazione4 e incubando a 37°C per 4 ore. A scelta, la reazione può essere interrotta mediante l'aggiunta di EDTA o l’inattivazione termica a 65°C.

Vengono poi rimosse le impurezze, come l'enzima di restrizione, la BSA, i frammenti di DNA, le endotossine e altro. La maggior parte dei processi su scala di laboratorio utilizza una tecnica di estrazione con solvente, non applicabile però agli ambienti di produzione che osservano le GMP.

In alternativa, per la fase di purificazione si può ricorrere a due efficienti tecniche quali la filtrazione a flusso tangenziale (TFF) e la cromatografia.

Il passaggio successivo prevede la trascrizione in vitro durante la quale il pDNA linearizzato, che funge da stampo, viene trascritto in mRNA. Questa reazione enzimatica utilizza i normali elementi del processo di trascrizione, tra cui l'RNA polimerasi e i nucleotidi trifosfati. Dopo la trascrizione, per ottenere l’mRNA maturo è necessario aggiungere un cap al 5', che ne aumenta la stabilità e l’efficienza di trasduzione nella cellula.

Il cap può essere aggiunto tramite la modalità co-trascrizionale o quella enzimatica. Il capping co-trascrizionale prevede l’aggiunta di analoghi del cap e guanosina trifosfato (GTP) nella miscela di trascrizione in rapporto 4:1. Dopo una fase di incubazione a 37°C, il DNA stampo viene solitamente degradato aggiungendo le DNasi; i piccoli frammenti di DNA risultanti possono quindi essere facilmente separati dalle molecole di mRNA più grandi mediante filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Un'altra opzione per rimuovere il DNA stampo prevede il ricorso alla cromatografia (ad esempio per cattura mediante Poli(dT)). Quest’ultima opzione non richiede la digestione del DNA stampo, il che evita il rischio che i piccoli frammenti di DNA digerito formino ibridi con l'mRNA.4

Il capping co-trascrizionale è meno costoso e più veloce del capping enzimatico poiché viene eseguito durante la fase di trascrizione, direttamente nella miscela del reattore. Tuttavia, l'efficienza e la resa sono inferiori e c’è il rischio di generare impurezze prive di cap poiché il GTP può legarsi alla sequenza dell’mRNA anziché agli analoghi del cap. Inoltre, gli analoghi del cap possono essere incorporati con orientamento invertito. Per ovviare a questo rischio, sono stati sviluppati appositi analoghi chiamati ARCA (antireverse cap analogs), che evitano l’incorporazione invertita del cap al 5', risultando in una maggiore efficienza di traduzione.

Il capping enzimatico viene eseguito dopo che l'mRNA è stato purificato dalla miscela di trascrizione in vitro. L’aggiunta del cap alla struttura dell’mRNA utilizza di solito l’enzima VCE (Vaccinia virus Capping Enzyme). Sebbene il capping enzimatico abbia un'efficienza molto elevata, esso è più costoso e richiede una fase aggiuntiva.

Purificazione di mRNA

Al termine della fase di trascrizione in vitro, l’mRNA viene purificato dalle impurezze e dai materiali utilizzati nelle fasi precedenti tra cui endotossine, RNA a doppio filamento (dsRNA) immunogenico, DNA stampo residuo, RNA polimerasi e impurezze elementali. Per la purificazione dell’mRNA si può scegliere tra diverse opzioni.

La TFF permette un’efficiente separazione dell’mRNA dalle impurezze più piccole che non vengono trattenute dalla membrana; in base alle dimensioni dell’mRNA, si può ricorrere a un taglio molecolare (MWCO) compreso tra 30 e 300 kDa. La TFF consente di purificare, concentrare e diafiltrare il prodotto nell’ambito della stessa operazione unitaria. In questa fase, l’mRNA dovrà trovarsi nel tampone appropriato, vuoi per il capping enzimatico o per la purificazione cromatografica. Tuttavia, una considerazione importante quando si ricorre alla TFF è che piccoli frammenti di DNA potrebbero ibridizzare l’mRNA, generando altre impurezze. Come detto in precedenza, il rischio è escluso se per rimuovere il DNA stampo si ricorre alla cattura cromatografica.5

Diverse sono le tecniche cromatografiche utilizzabili invece della TFF, come la coppia ionica in fase inversa, lo scambio anionico e la cromatografia di affinità mediante cattura con poli(dT) (Tabella 1).

Confronto tra coppia ionica in fase inversa, scambio anionico e cromatografia di affinità per la purificazione di mRNA. DBC: capacità di legame dinamico

Tabella 1.Confronto tra coppia ionica in fase inversa, scambio anionico e cromatografia di affinità per la purificazione di mRNA. DBC: capacità di legame dinamico.3,4

La cromatografia costituisce un mezzo efficace per la rimozione del DNA stampo ed evita il rischio di ibridazione durante la fase di ultra/diafiltrazione. È, però, più costosa e un passaggio di TFF sarà comunque necessario per lo scambio di tampone e la preparazione alla fase successiva.

Si ricorre alla cromatografia anche dopo il capping enzimatico per rimuovere i prodotti indesiderati e i contaminanti oligonucleotidici derivanti dalle precedenti fasi della reazione enzimatica.

La coppia ionica in fase inversa è comunemente utilizzata quando si opera su piccoli volumi; consente una purificazione dell’RNA rapida e molto efficiente e una buona separazione dell’RNA a singolo filamento (ssRNA) dal DNA, dall’RNA a doppio filamento (dsRNA) e dai trascritti brevi. Tuttavia, il fatto che questa tecnica richieda l’impiego di solventi, la rende poco adatta per i processi produttivi che seguono le GMP. Inoltre, componenti essenziali di questa metodica sono i reagenti di coppia ionica; i complessi con l’mRNA risultanti potrebbero richiedere estese fasi di diafiltrazione per la rimozione. Infine, la sua sensibilità allo sporcamento ad opera di proteine e aggregati la rende più adatta per la fase di purificazione finale che quella di cattura.

Lo scambio anionico è caratterizzato da una elevata capacità di legame dinamico ed è molto efficiente per la rimozione di impurezze dotate di attività immunogena come dsRNA, RNA senza cap, ibridi RNA–DNA e altre strutture dell’RNA. Benché consenta il ricorso a soluzioni acquose, potrebbe richiedere l’aggiunta di agenti caotropici potenzialmente tossici e temperature d’esercizio anche di 85°C per il desorbimento delle macromolecole di mRNA legate alla resina. Operando a temperatura ambiente normalmente si eluiscono le specie di mRNA di lunghezza inferiore a 500 basi.3

Nella cromatografia di affinità mediante cattura con poli(dT) si utilizza una resina per catturare in maniera specifica la coda poli(A) degli mRNA trascritti a lunghezza piena. Questo processo consente di rimuovere efficientemente DNA, nucleotidi, enzimi, componenti dei tamponi e tutte le altre impurezze che non presentano una coda poli(A).

L’altra faccia della medaglia è che questa tecnica, a differenza della fase inversa e dello scambio anionico, non è in grado di discriminare tra dsRNA e ssRNA. Inoltre, la cattura con poli(dT) non è efficiente nella rimozione di altre impurezze correlate al prodotto come gli ibridi tra frammenti di DNA e mRNA. Per questo motivo, nella fase cromatografica iniziale si utilizza la cromatografia di affinità cui fa normalmente seguito lo scambio anionico per la purificazione finale.

Dopo la/e fase/i cromatografica/he, si procede alla concentrazione fiale e alla diafiltrazione al fine di ottenere la massima purezza e di trasferire l’mRNA nel tampone appropriato per la formulazione o lo stoccaggio. In questo stadio, l’mRNA può essere ulteriormente purificato, concentrato e diafiltrato nell’ambito della stessa operazione unitaria. Dopo questa fase di TFF, è possibile operare una filtrazione sterilizzante. Va segnalato, però, che la filtrazione di grado sterilizzante di alcuni mRNA di peso molecolare da 5.000 kDa in su può essere difficoltosa.

Formulazione dell'mRNA

I sistemi di veicolazione sono ugualmente importanti sia per l’efficacia dei vaccini che degli agenti terapeutici a mRNA. Dopo la purificazione finale dell’mRNA, la prima considerazione da fare è proprio quella relativa al meccanismo di veicolazione (Figura 3). Alcuni tra i sistemi più avanzati nascono dalla combinazione di lipidi e polimeri. Tra essi i complessi di oligonucleotidi legati a lipidi a formare lipoplessi, oppure a polimeri carichi positivamente, come la polietilenimmina (PEI), a formare poliplessi.

Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono utilizzate soprattutto per la veicolazione dell’mRNA; ogni nanoparticella lipidica consiste di quattro diverse tipologie di lipidi che rendono possibile il trasporto dell’RNA messaggero all’interno della particella e lo proteggono dalla degradazione.

I lipidi cationici/ionizzabili sono necessari per consentire l’incapsulazione dell’RNA grazie a interazioni elettrostatiche. Il trasporto agli epatociti (per incrementare o silenziare l’espressione proteica) richiede l’impiego di lipidi ionizzabili (targeting passivo, rilascio endosomiale); l’uptake da parte delle cellule immunitarie, invece, è molto più semplice e si verifica anche con lipidi cationici forti.

Sono disponibili diversi sistemi per la veicolazione dell’mRNA.

Figura 3.Sono disponibili diversi sistemi per la veicolazione dell’mRNA.

Questi lipidi sono responsabili anche di un’efficiente liberazione dell’RNA nel citoplasma. La struttura dei lipidi cationici è strettamente correlata all’attività delle LNP, alla loro tossicità e alla biodistribuzione che, a sua volta, svolge un ruolo importante per quanto riguarda possibili effetti tossici.

I lipidi coniugati a glicole polietilenico (PEG) assicurano la stabilità del sistema colloidale ed evitano il binding proteico delle particelle, schermandole quindi dal sistema immunitario e prolungandone la circolazione nel sangue. La lunghezza della catena di PEG e delle catene degli acidi grassi determina la durata della persistenza in circolo e la fusogenicità, cioè la capacità delle particelle di fondersi con la membrana endosomiale. Se l’obiettivo è una persistenza in circolo prolungata, si può ricorrere ad acidi grassi a catena lunga, come il polietilene glicoldistearoilglicerolo (DSG PEG 2000). Inoltre, la concentrazione del PEG influenza le dimensioni delle particelle. Infine, l’impiego del PEG può indurre la formazione di anticorpi anti-PEG con il rischio di rendere inutile l’immunizzazione.

I lipidi neutri/anionici conferiscono stabilità strutturale e svolgono un ruolo ai fini della fusogenicità e della biodistribuzione. Se si considera, ad esempio, la 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolammina, un recente studio1 ha evidenziato che le LNP contenenti 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolammina (DOPE), che gioca un ruolo importante nel rilascio endosomiale, determinano un incremento del trasporto di mRNA al fegato rispetto alla 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC). Studi recenti2 suggeriscono che questi “lipidi helper” contribuiscono anche a una stabile incapsulazione dell’RNA.

Il colesterolo è utilizzato per modulare la densità e la fluidità del doppio strato, ma anche l’uptake (formazione di raft) delle LNP. Benché in distribuzione si trovi sia colesterolo di origine animale, sia ottenuto per via sintetica, il colesterolo sintetico offre diversi vantaggi tra i quali maggior purezza, assenza di molecole di origine animale come i prioni, scalabilità e qualità estremamente uniforme.

Considerazioni circa la scelta dei lipidi I lipidi vanno scelti in vista della via di somministrazione desiderata, in modo da raggiungere la massima efficacia e una biodistribuzione ottimale. Oltre alla scelta dei lipidi, un altro fattore importante da modulare con precisione perché influisce direttamente sulla fluidità del doppio strato e sulla fusogenicità delle LNP è il rapporto tra i diversi lipidi.

Quando si scelgono i lipidi, è necessario prendere in considerazione numerosi aspetti. Il tipo di lipide, la sua origine e la sua qualità esercitano un’influenza diretta sul profilo delle impurezze e su proprietà quali le caratteristiche e la stabilità delle particelle, ma anche sul profilo di rilascio della formulazione finale. Per ottenere risultati riproducibili con la formulazione finale, i lipidi devono presentare le opportune caratteristiche di materiale e qualità costante, la quale, a sua volta, dipende dalla qualità delle materie prime impiegate per la sintesi dei lipidi stessi.

L’mRNA purificato può essere formulato nelle particelle di trasporto attraverso diverse metodologie. Nella tecnica comunemente utilizzata della iniezione con solvente, i lipidi vengono sciolti in un solvente come etanolo e rapidamente miscelati, mediante miscelazione a flusso incrociato o microfluidica, con un tampone acquoso a basso pH contenente l’mRNA. Si procede quindi alla diafiltrazione del tampone a basso pH sostituendolo con un tampone a pH neutro e si concentrano le particelle mediante ultrafiltrazione.

Questa fase di TFF deve essere rapida perché a bassi valori di pH i lipidi potrebbero idrolizzarsi generando impurezze, come gli idrolipidi, in grado di influenzare la struttura del doppio strato, la stabilità della formulazione e le caratteristiche di rilascio. Inoltre, la degradazione lipidica può determinare un incremento delle dimensioni delle particelle e la conseguente aggregazione.

Rispetto ad altri sistemi di veicolazione, le LNP sono caratterizzate da ottima stabilità, plasticità strutturale e una consegna genica più efficace. Assicurano un maggior tasso di trasfezione rispetto all’mRNA nudo, ne consentono l’iniezione per via endovenosa proteggendolo dal rischio di degradazione da parte delle RNasi presenti in circolo e consentono anche il targeting attivo se si incorporano ligandi specifici.

Tra gli svantaggi associati alle LNP, il fatto che esse per la logistica possono richiedere la catena del freddo. Inoltre, non sempre le LNP possono essere sterilizzate mediante filtrazione; in tal caso è necessario prendere in considerazione alternative quali la sterilizzazione a raggi gamma, a caldo, ad alta pressione o le metodologie di processo chiuso.

Per una presentazione più dettagliata della formulazione dei prodotti a mRNA, dei suoi parametri critici e delle relative considerazioni, rimandiamo al webinar: "Key to Successful Formulation Development for Lipid Based RNA Delivery".

Considerazioni sullo scale-up

Quando ci si accinge allo scale-up di un processo per la produzione di mRNA è necessario tenere presente diverse considerazioni, le quali devono essere addirittura in cima alle priorità durante lo sviluppo del processo quando si opera su piccola scala.

  • I metodi che per la purificazione dell’mRNA prevedono fasi di estrazione in solvente e di precipitazione sono difficilmente scalabili, mentre i solventi pericolosi non sono compatibili con gli ambienti GMP ed è, pertanto, preferibile sostituirli con la TFF o la cromatografia.
  • Poiché l’mRNA può essere degradato dalle RNasi nel giro di qualche secondo, questi enzimi devono essere assenti in tutte le materie prime, le soluzioni e l’attrezzatura che vengono a contatto con il prodotto.
  • Un appropriato sistema di veicolazione contribuisce all’efficacia del vaccino o dell’agente terapeutico e deve essere scelto con attenzione.
  • Se il prodotto finale è un grande complesso di mRNA, è opportuno valutare l’opportunità di ricorrere ad alternative della filtrazione sterilizzante.
  • Esigenze straordinarie per la catena di approvvigionamento (es. catena del freddo) sono un fattore di costo significativo. È pertanto necessario stimare attentamente la stabilità del prodotto.

Un futuro brillante

La tecnologia a mRNA ha permesso di sviluppare candidati vaccini contro il COVID-19 con una velocità senza precedenti e con tassi d’efficacia eccezionali. In futuro, questa tecnologia non solo rivoluzionerà lo sviluppo dei vaccini consentendo di reagire rapidamente contro le epidemie, ma contribuirà anche a combattere malattie per le quali ancora non c’è risposta con approcci terapeutici genici.

L’mRNA ha le potenzialità per costituire una piattaforma vaccinale rapida e flessibile, grazie alla quale lo sviluppo di un nuovo vaccino potrà ora incentrarsi sullo sviluppo del processo e non sarà più una sfida scientifica. Una volta nota la sequenza genetica del patogeno, le aziende possono ideare i vaccini a mRNA in maniera relativamente rapida. Tuttavia, per essere certi che questo approccio terapeutico esprima tutto il suo potenziale, è necessario che soluzioni innovative, competenza e ingegnosità si fondano insieme per dar vita a una piattaforma semplice e robusta per la produzione su larga scala. Sarà necessario anche rispondere alle preoccupazioni sollevate riguardo la sicurezza, l’efficacia, la qualità e la producibilità dei costrutti di mRNA sviluppati e dei sistemi di veicolazione.

Una volta risolte tutte queste difficoltà, i vaccini e gli agenti terapeutici a mRNA si conquisteranno probabilmente un posto tra gli agenti innovativi consentendo di raggiungere risultati considerevoli con i pazienti di tutto il mondo.

Bibliografia

1.
Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3
2.
Kulkarni JA, Witzigmann D, Leung J, Tam YYC, Cullis PR. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. 11(45):21733-21739. https://doi.org/10.1039/c9nr09347h
3.
Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. ION EXCHANGE PURIFICATION OF MRNA (Brevetto N° WO/2014/144767 A1).. [Internet].
4.
Bancel S, Issa J, Aunins J. Ribonucleic acid purification (Brevetto N° WO2014152031A1).. [Internet].
5.
Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Brevetto N° WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en
Autenticati per continuare

Per continuare a leggere, autenticati o crea un account.

Non hai un Account?