Metodika SPE v obrácené fázi

Přečtěte si více o

• Vodná matrice vzorku/prostředí mobilní fáze
• Základní kroky
• Základní kroky
SPE tipy

Vodná matrice vzorku/prostředí mobilní fáze

SPE na obrácené fázi je považována za nejméně selektivní retenční mechanismus ve srovnání s SPE na normální fázi nebo iontově výměnnou SPE. Jinými slovy, pro metodu s obrácenou fází nebo vázanou chemii může být obtížné rozlišit molekuly, které jsou si strukturně podobné. Protože však obrácená fáze zadrží většinu molekul s jakýmkoli hydrofobním charakterem, je velmi užitečná pro extrakci analytů, které mají v rámci jednoho vzorku velmi různorodou strukturu.

Obrázek 1. Vodná matrice vzorku / prostředí mobilní fáze

Základní kroky

1. Předběžné zpracování vzorku: U vzorků zatížených interferencemi (např.g., biologické tekutiny) zřeďte vzorky pufrem v poměru 1:1. Při práci s ionizovatelnými sloučeninami může být důležitá manipulace s pH. Ionizační stav sloučeniny může drasticky změnit její retenční a eluční vlastnosti na daném sorbentu SPE.
   
   Když je analyt v neutrální formě, stává se hydrofobnějším a retence se za podmínek reverzní fáze zesiluje. Úprava pH vzorku na hodnotu o 2 jednotky pH vyšší nebo nižší než pKa sloučeniny (v závislosti na funkční skupině) sloučeninu účinně neutralizuje. Při práci s tkáněmi a jinými pevnými látkami proveďte extrakci pevná látka-kapalina nebo homogenizaci pomocí pufru. Rozpouštědla nepolární povahy (včetně metanolu a isopropanolu) narušují interakci mezi sloučeninou a funkčními skupinami sorbentu.
   
   Aby se zabránilo ucpání, může být nutné vzorek před
   zavedením do fáze SPE odstředit, zředit a/nebo předfiltrovat.
   
   
2. Kondicionování/ekvilibrace: Kondicionování smáčí nebo aktivuje vázané fáze, aby byla zajištěna konzistentní interakce mezi analytem a funkčními skupinami sorbentu. Sorbenty s obrácenou fází se často kondicionují 1-2 objemy zkumavky s rozpouštědlem mísitelným s vodou, jako je metanol nebo acetonitril.
   
   Ekvilibrací se zavádí roztok podobný zátěži vzorku, pokud jde o sílu rozpouštědla a pH, aby se maximalizovala retence. Pro ekvilibraci na obrácené fázi jsou dobrou volbou 1-2 zkumavkové objemy pufru (používaného při předúpravě vzorku) nebo vody.
   
   
3. Zatížení vzorku: Naneste vzorek (z kroku 1) při konstantní a snížené průtokové rychlosti ~1-2 kapky za sekundu, abyste zajistili optimální retenci.
   
   
4. Propláchnutí: Interference ve vzorku se často zadržují společně se sloučeninami, které jsou předmětem zájmu, během načítání vzorku. Promývací krok je nutný k eluci interferencí bez předčasné eluce zájmových sloučenin. Pro promývací rozpouštědla je typický 5-20% methanol ve vodě nebo pufr pro předúpravu vzorku.
   
   
5. Eluce: Narušte hydrofobní interakce mezi analytem a funkčními skupinami sorbentu organickým rozpouštědlem nebo kombinací rozpouštědel dostatečně nepolárního charakteru. Příkladem elučních rozpouštědel jsou 1-2 objemy methanolu nebo acetonitrilu.
   
   Manipulace s pH během eluce může často zlepšit výtěžnost při práci s ionizovatelnými sloučeninami. V iontové formě se zásadité a kyselé sloučeniny stávají polárnějšími, což oslabuje interakci s reverzní fází, případně umožňuje použití slabších elučních rozpouštědel a/nebo snížení elučních objemů.
   
   
6. Postupná úprava eluátu: Před LC analýzou je často nutné eluát SPE odpařit a rekonstituovat v mobilní fázi. GC analýza často vyžaduje další zahuštění eluátu SPE a/nebo případnou výměnu matrice s těkavějším rozpouštědlem.

SPE tipy

1. Vazba léků a proteinů by měla být narušena během předúpravy vzorku.
   Strategie zahrnují:
   • 40 µl 2% disodné EDTA na 100 µl myší plazmy
   • 40 µl 2% kyseliny mravenčí na 100 µl myší plazmy
   • Další možná činidla (na 100 µl matrice):
     40 µL 2% TCA, 40 µL 2% kyseliny octové, 40 µL 2% TFA, 40 µL 2% kyseliny fosforečné nebo 200 µL MeCN (protein ppt.).
   
   
2. Pokud je třeba eluát SPE před analýzou odpařit, propouštějte přes zkumavku SPE vakuový vzduch po dobu ~ 10 minut po eluci. Tím se odstraní zbytková vlhkost, která může prodloužit odpařování.
   
   
3. Stálá a pomalá rychlost průtoku (1-2 kapky za sekundu) během vkládání vzorku a eluce zlepší výtěžnost a reprodukovatelnost.
   
   
4. Snížením hmotnosti lože minimalizujete eluční objem.
   
   
5. Zvýšením hmotnosti lože zachytíte více polárních sloučenin.
   
   
6. Obava z přesušení sorbentu je kritická pouze při úpravě metanolem.
   
   
7. Před kondicionováním lze použít předkondicionující rozpouštědlo, jako je dichlormethan (nebo rozpouštědlo používané pro eluci), aby se odstranily veškeré nečistoty na SPE trubici, které mohou narušit následnou analýzu.