Pengurutan

Sanger Sequencing

Pada awalnya, metode kimia analitik mampu menentukan komposisi asam nukleat. Namun, Fred Sanger dan rekan-rekannya mengembangkan metode - awalnya menggunakan fragmen yang dicerna dengan radiolabel dan fraksinasi dua dimensi - untuk memberikan beberapa urutan nukleat lengkap pertama. Kemajuan di bidang ini terus berlanjut selama beberapa dekade, dengan setiap peningkatan menambah perpustakaan protein dan genom yang diurutkan yang terus berkembang. Peningkatan ini termasuk pemisahan nukleotida berdasarkan panjangnya menggunakan elektroforesis gel yang diikuti dengan elektroforesis kapiler. Selain itu, penggabungan nukleotida berlabel fluoresen dan analisis komputer otomatis dari setiap fragmen asam nukleat kini mendefinisikan metode pengurutan Sanger modern.

Metodologi Pengurutan DNA

Meskipun metode pengurutan DNA terus berkembang sejak awal mula teknologi ini, beberapa komponen mendasar masih diperlukan dan digunakan oleh platform pengurutan DNA modern. Persiapan DNA biasanya meliputi isolasi dan pemurnian DNA dari organisme inang. Komponen penting tambahan, termasuk basa DNA bebas, primer DNA, basa DNA yang dimodifikasi yang mengandung penanda fluoresen (basa terminator), dan DNA polimerase ditambahkan bersama ke dalam satu wadah. Bejana yang berisi semua komponen ini melalui serangkaian langkah pemanasan dan pendinginan akan menghasilkan pustaka urutan DNA kecil yang relatif terhadap urutan DNA panjang penuh yang diinginkan, masing-masing diakhiri dengan basa terminator yang diberi label fluoresen. Untaian DNA baru yang mengandung nukleotida berlabel ujung fluoresen dipisahkan berdasarkan panjangnya, dilewatkan melalui tabung kapiler, dan disusun berdasarkan ukurannya. Laser kemudian digunakan untuk merangsang basa fluoresen pada setiap untai sementara kamera menangkap sinyalnya. Terakhir, komputer biasanya digunakan untuk menyusun informasi yang terkumpul ke dalam urutan DNA lengkap.